产品详情
维生素 D3 含量检测试剂盒说明书
高效液相色谱法
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
规格:50T/48S
产品简介:
维生素 D3 是一种脂溶性维生素。维生素 D3 的生物学功能与其代谢产物钙三醇密切相关,主要
功能包括提高机体对钙和磷的吸收、促进新骨的生成及钙化、调节肝脏中钙结合蛋白质的合成等。
维生素 D3 在 265 nm 处存在紫外吸收,可利用紫外检测器测定其含量。
试验中所需的仪器和试剂:
高效液相色谱仪(ZORBAX Extend C18 色谱柱(4.6×250 mm),紫外检测器(VWD))、台
式离心机、可调式移液枪、研钵/匀浆器、混匀仪、EP 管、针头式过滤器(有机系)、注射器、抽滤器、滤膜(水系、有机系)、棕色进样瓶、超纯水、甲醇(色谱纯)。
产品内容:
提取液:液体 60 mL ×1 瓶,4℃保存。
标准品:粉剂×1 瓶,4℃避光保存。临用前加入 1 mL 甲醇配制成 5 mg/mL 维生素 D3 标准溶
液,4℃密封保存,避免阳光直射。
实验前准备工作:
1. 将甲醇(色谱纯)用有机系滤膜抽滤。
2. 将抽滤好的流动相超声 20 min,除去气泡。
4. 标准品的配制:将 5 mg/mL 的维生素 D3 标准溶液用甲醇稀释成 1000 μg/mL、500 μg/mL、100μg/mL、20 μg/mL、4 μg/mL、0.8 μg/mL 的维生素 D3 标准溶液。4℃避光保存(密封),测试前采用有机系针头式过滤器过滤到棕色进样瓶内,待测。
操作步骤:
一、维生素 D3 的提取:
按组织质量(g): 提取液体积(mL)1:5~10 比例进行提取,建议称取约 0.2 g 样本,加入 1 mL提取液,冰浴匀浆,室温条件下密封避光漩涡剧烈震荡 30 min 后 10000 rpm 离心 10 min,取上清液,测试前采用有机系针头式过滤器过滤到棕色进样瓶内,待测。
二、测定步骤:
1. 开启电脑、打开高效液相色谱仪各模块开关按钮,安装上色谱柱,打开软件,在方法组中设置进样量为 10 μL,柱温 30℃,流速为 1 mL/min,紫外检测器波长为 265 nm。单个样本走样时间 15min,设置完毕保存方法组。
3. 采用相应的流动相清洗柱子,用流动相平衡柱子,待基线稳定后开始加样。
4. 检测待测的标准品溶液,进样量为 10 μL,在 15 min 内可分离出维生素 D3,维生素 D3 的保留时间约为 10 min(体系、柱子、流动相 pH、温度等不同,保留时间有差异,仅作为参考)。
5. 检测待测的样品溶液,进样量为 10 μL,在相应的保留时间处检测维生素 D3 的峰面积。
注意:单个样本测定完成后注意样本物质是否还有残留,必要时可相应延长后运行时间进行色谱柱的清洗。
三、维生素 D3 含量计算
以标准品浓度(μg/mL)为横坐标 x,峰面积为纵坐标 y 绘制维生素 D3 的标准曲线,将样本的
峰面积代入标准曲线 y=kx+b,计算提取液中维生素 D3 的浓度 x(μg/mL)。
维生素 D3 的含量(μg/g)= x×V 提取÷W×F= x÷W×F
V 提取:加入提取液体积,1 mL;W:样本质量,g;F:稀释倍数,稀释后测试的样本,计算
时需要乘以相应的稀释倍数。
注意事项
1. 测试完毕后,需要用高浓度的超纯水相清洗色谱柱(约 20-30 个柱体积),再用高浓度的有机相冲洗色谱柱,最 后按柱子的种类规范冲洗,防止损伤色谱柱。
2. 标准品的稀释倍数要根据样品中维生素 D3 的浓度确定,样品中维生素 D3 的浓度必须在标准品溶液的浓度范围之内,该标准品的稀释倍数只是一个参考。若样本中维生素 D3 浓度过高,建议稀释后再测。
3. 若样本量过大,建议每天测试一次标准溶液(一个标准溶液即可),以确定相应的保留时间,待测溶液测试前须放置至室温状态。
4. 为了排除溶剂的影响,可进行一次空白检测。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!