产品详情
4-香豆酸:辅酶 A 连接酶(4CL)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格: 100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 提取液:内含不溶物,使用前摇匀;
2、 试剂二:临用前加入 3 mL 蒸馏水溶解,可以分装后-20℃保存,避免反复冻融;
3、 试剂四:临用前用 4 mL 蒸馏水溶解备用,可以分装后-20℃保存,避免反复冻融;
4、 试剂五:加入 1 mL 乙醇溶解,临用前用蒸馏水稀释 40 倍后备用,现用现配;
5、 工作液的配制:按体积比将试剂二:试剂三:试剂四:试剂五=1:1:1:1 的比例配制工作液,现用现配。
产品说明:
4-香豆酸:辅酶 A 连接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)是木质素生物合成的关键酶之一,主要催化肉桂酸及其羟基或者甲氧基衍生物生成相应的辅酶 A 酯,这些中间产物随后进入苯丙类衍生物支路合成途径。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中,研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理,为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。
4CL 催化 4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA,其在 333nm 下测有特征吸收峰,测定 4-香豆酸 CoA 的生成速率,即可反映 4CL 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 333nm,蒸馏水调零。
2、 操作表(在 0.5mL EP 管中进行下列操作):
三、4CL活性计算
注意事项:
1、 若 ΔA 大于 0.5,将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。
2、 建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。
3、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过 0.01。
实验实例:
1、 取0.1g芥菜加1mL提取液进行样本处理,取上清后按照测定步骤操作,使用微量石英比色皿测得ΔA测定管=A2测定管-A1 测定管=0.7425-0.5851=0.1574,ΔA 空白管= A2 空白管-A1 空白管=0,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.1574,按样本质量计算酶活得:4CL(U/g 质量)=476.19×ΔA÷W=476.19×0.1574÷0.1=749.52 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!