产品详情
肉桂酸-4-羟化酶(C4H)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 2 mL 乙醇溶解备用。2-8℃保存 4 周。
2、 试剂三:临用前每瓶加入 2 mL 双蒸水充分溶解待用。现配现用。-20℃分装可保存 4 周,避免反复冻融。
产品说明:
C4H又称反式肉桂酸-4-单氧化酶,是催化桂皮酸形成咖啡豆、香豆酸的酶。C4H多存在于高等植物、酵母、菌类中,属于细胞木质素合成途径中间的关键酶。
C4H催化肉桂酸和NADPH生成4-香豆酸盐和NADP,在340nm下测定NADPH的减少速率,即可反映C4H活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 15 分钟,取上清,置冰上待测。
2、细胞或细菌样本的制备:先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。12000g,4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min,波长调至340nm,蒸馏水调零。
2、 加样表(微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入)
充分混匀后立即测定 10s 时在 340nm 下的吸光度,记为 A1,之后迅速将其放入 37℃水浴或 37℃培养箱中 3min(若酶标仪带有控温功能,将温度调为 37℃)。然后迅速拿出擦净后测定 190s 时的吸光度,记为 A2。计算ΔA=A1-A2。
三、C4H酶活计算
注意事项:
当ΔA大于0.4时,建议将样本用提取液稀释后测量;ΔA过小时,建议增加酶促反应时间(5min或10min)或增加加入的样本体积来测定。
实验实例:
1. 取 0.1g 黄豆(发芽)加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,使用微量石英比色皿测得计算ΔA=A1-A2=1.1227-0.9854=0.1373,按样本质量计算酶活得:
C4H 酶活(U/g 质量)=535.91×ΔA÷W=535.91×0.1373÷0.1=735.80 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!