产品详情
ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 500 μL 试剂一,充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;
2、 试剂三:临用前加入 2 mL 试剂一,充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;
3、 试剂四:临用前加入 0.5 mL 试剂一,充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;
4、 试剂五:临用前加入 0.5 mL 试剂一,充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;
5、 提取液的配制:按提取液一︰提取液二=990︰10(V︰V)的比例配制,根据样本量现配现用,禁止将提取液二一次性全部加入提取液一混匀分装待用。
产品说明:
ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)是催化柠檬酸生成乙酰辅酶A的关键胞质酶,其催化产生的乙酰辅酶A是合成脂肪酸与胆固醇等脂类物质的主要原料,并可参与相关重要蛋白的修饰作用,是体内能源物质代谢的枢纽性物质。
在ATP和辅酶A存在的情况下,ACL能将柠檬酸催化裂解为乙酰辅酶A、草酰乙酸、ADP和磷酸盐,,苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+,导致340nm处光吸收下降。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、天平、台式低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、水浴锅、冰盒。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照质量(g)︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例(建议称取约 0.1g,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆。于 4℃,8000g 离心 10min,取上清,置于冰上待测。
2、细胞或细菌:按照细胞或细菌数量(104个)︰提取液体积(mL)为 500~1000︰1 的比例(建议 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min),于 4℃,8000g 离心 10min,取上清,置于冰上待测。
3、血清(浆)或其他液体:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂一置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min。
3、 操作表 (在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中依次加入下列试剂) :
三、ACL活性计算
A、按微量石英比色皿计算:
1. 按样本蛋白浓度计算
单位定义:每 mg 蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位
ACL 活性(U/mg prot)=[ΔA×V 反总×109÷(ε×d)]÷(V 样×Cpr) ÷T=1607.7×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算
单位定义:每 g 组织每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ACL 活性(U/g 质量)=[ΔA×V 反总×109÷(ε×d)]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=1607.7×ΔA÷W
3. 按照细胞数量计算
单位定义:每 1 万个细胞或细菌每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ACL 活性(U/104 cell)=[ΔA×V 反总×109÷(ε×d)] ÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=3.215×ΔA
4. 按液体体积计算
单位定义:每 mL 液体每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ACL(U/mL)=[ΔA×V 反总×109÷(ε×d)]÷V 样÷T=1607.7×ΔA
V 反总:反应总体积,2×10-4L;109:单位换算系数,1mol=109nmol;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;
d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;500:细胞或细菌数量,500 万。
B、按照 96 孔 UV 板计算将将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。
实验实例:
1. 取 0.1g 黑麦草,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆,于 4℃,8000g 离心 10min,取上清,按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管= A1 测定-A2 测定=1.7569-1.7034=0.0535,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.459-0.457=0.002,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.0535-0.002=0.0515,按样本质量计算得:
ACL 活性(U/g 质量)=1607.7×ΔA÷W=827.9655 U/g 质量。
2. 取 0.1g 肝脏组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆,于 4℃,8000g 离心 10min,取上清,按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算 ΔA 测定管= A1 测定-A2 测定=1.2341-1.0503=0.1838,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.459-0.457=0.002,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.1838-0.002=0.1818,按样本质量计算得:
ACL 活性(U/g 质量)=1607.7×ΔA÷W=2922.7986 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!