产品详情
鸟氨酸转氨酶(δ-OAT)活性检测试剂盒说明书
微量法
规格: 100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加 5 mL 试剂一,充分溶解;用不完的试剂 4℃保存;
2、 试剂三:临用前加 5 mL 试剂一,充分溶解;用不完的试剂 4℃保存;
3、 试剂四:每瓶临用前加 10 mL 试剂一,充分溶解,-20℃分装保存;-20℃保存一周。
产品说明:
鸟氨酸转氨酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸的关键酶之一,对植物适应逆境胁迫起重要作用。鸟氨酸和 α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和 NADH 的作用下,可发生酰基转移反应,生成 NAD 和吡咯醛-5-羧酸(P5C),NADH在 340 nm 处有特殊吸收峰,通过检测在 340 nm 处吸光度的变化值,可计算出鸟氨酸转氨酶性高低。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织样本:按质量(g):提取液体积(mL)1:5~10 比例(建议称取 0.1 g 样本,加入 1.0 mL 提取液)加入提取液,冰浴匀浆后,于 4℃,12000 rpm,离心 10 min,取上清液置于冰上待测;
2、细胞样本:按细胞数量(104):提取液体积(mL)500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1.0 mL 提取液)加入提取液,冰浴超声破碎细胞(功率 300 W,超声 3 s,间隔 7 s,总时间 3 min);然后于 4℃,12000rpm,离心 10 min,取上清液置于冰上待测;
3、液体样本:直接测定。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上,调节波长至 340 nm,蒸馏水调零。
2、 将配好的试剂二、三、四置于 37℃预热 10 min。(用多少,预热多少)
3、 操作表:(在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中操作)
在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分别加入上述试剂,充分混匀后于 340 nm 处测定 10 s 时的吸光值 A1,迅速 置于 37℃水浴锅或培养箱 10 min(酶标仪有控温功能可将温度调至 37℃或 25℃),拿出迅速擦干测定 10 min10 s 时的吸光值 A2,计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定,ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管。 空白管只需做 1-2 次。
注意:加入样本时开始计时。
三、δ-OAT 酶活含量的计算
注意事项:
1. ΔA 高于 0.5 时,建议将样本稀释后检测,并在计算公式中乘以稀释倍数。若 ΔA 过小时,可以加大样本量或者延长酶促反应时间。
2. 将试剂依次加入后应尽量快速混匀并测定 OD 值,减少误差时间。
3. ΔA 空白管一般不会超过 0.05。
实验实例:
1、取 0.1g 红豆芽,进行样本处理,按照操作步骤进行测定(微量石英比色皿检测),计算得:ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定=0.1058,ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白=0,ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.1058,按照样本质量计算酶活得:
δ-OAT(U/g 质量)=160.77×ΔA÷W÷d=160.77×0.1058÷0.1÷1=170.09 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!