产品详情
抗坏血酸/总抗坏血酸(AsA/T-AsA)含量检测试剂盒(比色法)说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂一:临用前加入 3.3 mL 蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂-20℃分装避光保存。
2、 试剂六:临用前加入 12 mL 70%乙醇(V/V)溶液溶解。
3、 标准品:临用前配制,加入 1.136mL 提取液充分溶解;吸取 0.01 mL 上述溶液,加入 0.99 mL 提取液,混匀,即 500 nmol/mL AsA 标准溶液。
产品说明:
抗坏血酸(AsA)是辅酶、自由基清除剂、电子共体/受体和草酸盐与酒石酸盐生物合成的底物等。作为植物细胞中最重要的抗氧化剂,AsA 在保护叶绿体免于氧化损伤起着举足轻重的作用,也是衡量农作物产品品质的重要指标之一。脱氢抗坏血酸(DHA)是 AsA 的可逆的氧化型,在生物体内,与抗坏血酸共同组成氧化还原系统,具有电子受体作用。
AsA 具有还原性,能将 Fe3+还原成 Fe2+,Fe2+与 2,2’-联吡啶形成粉红色络合物,在 525nm 处有特征性吸收峰。DTT 可还原 DHA 生成 AsA,可用于检测样本总抗坏血酸(AsA+DHA)含量。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
研钵/匀浆器、冰、低温离心机、可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、可调式移液器、乙醇和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照组织质量(g): 提取液体积(mL)为 1: 5~10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加入 1 mL 提取液)进行冰浴匀浆。13000g,4℃离心 10 min,取上清置冰上待测。
2. 细胞或细菌:按照细胞数量(104个): 提取液体积(mL)为 500~1000 :1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300 W,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3 min);13000g,4℃离心 10min,取上清液置冰上混匀待测。
3. 血清等液体:取 500 μL 样本,加入 500 μL 提取液,漩涡混匀。13000g,4℃离心 10 min,取上清置冰上待测。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热 30 min,调节波长到 525 nm,蒸馏水调零。
2. AsA 含量测定
AsA 含量测定操作表,按照操作表加入下列试剂:
3. T-AsA 含量测定
T-AsA 含量测定操作表,按照操作表加入下列试剂:
注意:加入试剂七时将枪头伸入液面以下加入,不可悬空滴加,否则会导致液体浑浊。空白管 1、空白管 2及标准管只需测定 1-2 次。
三、AsA /T-AsA 含量计算公式
注意事项:
1. 加入试剂七时将枪头伸入液面以下加入,不可悬空滴加,否则会导致液体浑浊。
2. 空白管 1、空白管 2 及标准管只需测定 1-2 次。
3. A 大于 1 时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定,并在计算时乘以相应的稀释倍数。
4. 本试剂盒可单独用于检测样本中 AsA 或 T-AsA 含量,也可在同时检测 AsA 与 T-AsA 含量后计算 DHA 含量。
5. 样本提取后当天检测。
实验实例:
1、取 0.1g 冬枣进行样本处理,按照测定步骤操作,测得计算 ΔA1测定管=(A 测定管-A 对照管)-(A 空白管 1-A空白管 2)=(0.44-0.019)-(0.025-0.009)=0.402、ΔA1标准管=A 标准管-A 空白管 1=0.341-0.024=0.317,ΔA2测定管=(A 测定管-A 对照管)-(A 空白管 1-A 空白管 2)=(0.591-0.020)-(0.024-0.008)=0.555、ΔA2标准管=A 标准管-A 空白管 1=0.375-0.024=0.351,按照样本质量分别计算 AsA 含量及 T-AsA 含量得:
AsA(nmol/g 质量)=500×ΔA1 测定管÷ΔA1标准管÷W=6340.7 nmol/g 质量
T-AsA(nmol/g 质量) =500×ΔA2测定管÷ΔA2标准管÷W=7905.9 nmol/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!