产品详情
过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书(钼酸铵法)
微量法
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前取 1 瓶试剂二加入 12.5mL 蒸馏水,充分溶解,用不完的试剂 4℃保存一周。
2、 30μmol/mL 标准液的配制:标准品置于试剂瓶内 EP 管中,使用前需先离心。本试剂盒所提供标准品为1mmol/mL H2O2标准溶液,临用前取 0.15mL 标准品加入 4.85mL 试剂一稀释或者根据样本量按照比例配制,充分混匀,即为 30μmol/mL 标准液,现配现用。
产品说明:
CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是最主要的 H2O2清除酶,在活性氧清除系统中具有重要作用。
H2O2可与钼酸铵反应形成稳定的黄色复合物,在 405nm 处有强烈吸收峰,且其吸光值大小与过氧化氢浓度成正比。通过测定反应体系中剩余的 H2O2量,得出被 CAT 催化分解的 H2O2量,进而反映 CAT 的活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、恒温水浴锅、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌、细胞或组织样本的制备:
a、细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 9s,重复 30 次);8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
b、组织:按照组织质量(g): 提取液体积(V)=1: 5~10(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 405nm,蒸馏水调零。
2、 测定前将 30μmol/mL 标准液与试剂一在 25℃水浴 10min 以上。
3、 加样表:
三、CAT 活性计算
注意事项:
1. 本试剂盒多给出 25mL 的提取液,供样本稀释使用。
2. 如果反应液有大量气泡产生,将样本用提取液稀释后再进行测定。
3. 如果样本量过多,为保证反应时间(25℃,10min)的准确性,建议分成若干批次检测,每批次检测均需配 1-2 个空白管与标准管。
4. 当 A 测定小于 0.12 或者约等于 A 对照时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定。
5. 动物组织如肝脏、肾脏等酶活性较高样本,预实验建议将样本用提取液多个高倍稀释(如 25 倍、50 倍、100倍、200 倍等)试验后,再进行检测。
实验实例:
1、 取 0.1g 小鼠肝脏加入 1mL 提取液进行匀浆研磨,取上清用提取液稀释 200 倍后按照测定步骤操作,用 96 孔板测得计算 ΔA 标准=A 标准-A 空白=0.939-0.104=0.835,ΔA 测定=A 测定-A 空白=0.179-0.104=0.075,ΔA=ΔA标准-ΔA 测定=0.835-0.075=0.760。按样本质量计算酶活得:
CAT 酶活(U/g 质量)=15×(ΔA÷ΔA 标准)÷W×F=15×(0.76÷0.835)×200÷0.1=27305.39 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!