产品详情
吡哆醛含量检测试剂盒说明书
高效液相色谱法
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
规格:50T/48S
产品简介:
吡哆醛(pyridoxal,PL)是维生素 B6 的组成成分之一,是氧化吡哆醇所得到的醛,广泛存在
于肉类、谷类、蔬菜及坚果中。吡哆醛在生物体内主要的活性辅酶形式是磷酸吡哆醛(PLP),是
转氨酶、脱羧酶、消旋酶等多种酶的辅酶。
吡哆醛在一定条件的光激发下具有荧光效果,可以利用高效液相色谱法荧光检测器测定其含
量。荧光检测器灵敏度较高,常用于痕量分析。
试验中所需的仪器和试剂:
高效液相色谱仪(Polaris C18-A 色谱柱(4.6×250 mm),荧光检测器(FLD))、台式离心机、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP 管(1.5 mL)、针头式过滤器(水系)、注射器、抽滤器、滤膜(水系、有机系)、棕色进样瓶、超纯水、甲醇(色谱纯)。
产品内容:
提取液:液体 30 mL ×1 瓶,4℃保存;本提取液中含有不溶物,需摇匀后使用。
试剂一:液体 5 mL ×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 1.5 mL ×1 瓶, 4℃保存。
试剂三:粉剂×2 瓶,4℃保存。
标准品:粉剂×1 瓶,4℃避光保存。临用前加入 0.821 mL 蒸馏水配制成 5 mg/mL 吡哆醛标准
溶液,4℃密封保存,避免阳光直射。
实验前准备工作:
1. 将 1 瓶试剂三溶解到 1000 mL 超纯水中,再加入 0.55 mL 的试剂二,混匀,得到流动相 A。
2. 将 1000 mL 配制好的流动相 A、甲醇(色谱纯)用滤膜抽滤。(配制好的流动相 A 采用 0.22 μm水系滤膜抽滤,甲醇采用 0.45 μm 有机系滤膜抽滤)。
3. 将抽滤好的流动相超声 20 min,除去气泡。
4. 标准品的配制:将 5 mg/mL 的吡哆醛标准溶液采用倍比稀释的方法分别用蒸馏水稀释成
16000ng/mL、3200 ng/mL、640 ng/mL、128 ng/mL、25.6 ng/mL 的吡哆醛标准溶液。(标准品浓度仅供参考,可根据实际样品浓度进行调整)。4℃避光保存(密封),测试前采用水系针头式过滤
器过滤到棕色进样瓶内,待测。
操作步骤:
一、吡哆醛的提取:
组织样本:按质量(g):提取液体积(mL)1:5~10 比例,建议称取 0.1 g 样本(新鲜样本:剪
碎;烘干样本:研磨过筛),加入 0.6 mL 提取液(新鲜样本需匀浆),密封,混合均匀,置于 60℃水浴锅中浸取 30 min。冷却至室温,加入 0.1 mL 试剂一,0.3 mL 蒸馏水,混匀,静置 2 min。10000rpm 离心 10 min,取上清液(若仍有浑浊,可再次离心),测试前采用水系针头式过滤器过滤到棕色进样瓶内,待测(若上清液颜色过深或者浓度过高,可稀释后再次过滤待测)。
细胞:按细胞数量(104):提取液体积(mL)1000~5000 万:1 比例,建议取 5000 万细胞,加入
0.6 mL 提取液,超声破碎细胞(功率 20%,超声 3s,间歇 9s,重复 30 次,总时间:6 min),密封混匀,置于 60℃水浴锅中浸取 30 min。冷却至室温,加入 0.1 mL 试剂一,0.3 mL 蒸馏水,混匀,静置 2 min。10000 rpm 离心 10 min,取上清液(若仍有浑浊,可再次离心),测试前采用水系针头式过滤器过滤到棕色进样瓶内,待测。
血清:按血清体积(mL):提取液体积(mL)1~5:1 比例,建议取 0.5 mL 血清,加入 0.1 mL 提
取液,密封混匀,置于 60℃水浴锅中浸取 30 min。冷却至室温,加入 0.1 mL 试剂一,0.3 mL 蒸馏水,混匀,静置 2 min。10000 rpm 离心 10 min,取上清液(若仍有浑浊,可再次离心),测试前采用水系针头式过滤器过滤到棕色进样瓶内,待测。
二、测定步骤:
1. 开启电脑、打开液相色谱仪各模块开关按钮,安装上色谱柱,打开软件,在方法组中设置进样量为 10 μL,柱温:30℃,流速为 1 mL/min,荧光检测器:Ex=293 mn,Em=395 nm。单个样本走样时间 10 min,设置完毕保存方法组。
3. 采用相应的流动相清洗柱子,用流动相 A 平衡柱子,待基线稳定后开始加样。
4. 检测待测的标准品溶液,进样量为 10 μL,在 10 min 内可分离出吡哆醛,吡哆醛的保留时间为6.3 min 左右(体系、柱子、流动相 pH、温度等不同,保留时间有差异,仅作为参考)。
5. 检测待测的样品溶液,进样量为 10 μL,在相应的保留时间处检测吡哆醛的峰面积。
6. 序列完整加样表:(包含单个样本测定完成后色谱柱的清洗和再平衡过程)
三、吡哆醛含量计算
以标准品浓度(ng/mL)为横坐标,峰面积为纵坐标绘制吡哆醛的标准曲线,将样本的峰面积
代入标准曲线,计算提取液中吡哆醛的浓度 x(ng/mL)。
1. 组织样本
吡哆醛的含量(μg/g)= x ×V 提取÷W×F÷1000=0.001x÷W×F
V 提取:加入提取液总体积,1 mL;W:样本质量,g;F:样本稀释倍数(稀释后测试的样本,
计算时需要乘以相应的稀释倍数);1000:单位转化系数,1 μg=1000 ng。
2. 细胞样本
吡哆醛的含量(μg/104细胞)= x ×V 提取÷细胞数量(104)×F÷1000=0.001x÷细胞数量(104)×F
V 提取:加入提取液总体积,1 mL(0.6mL 提取液+0.1mL 试剂一+0.3mL 蒸馏水);细胞数量:
单位 104;F:样本稀释倍数(稀释后测试的样本,计算时需要乘以相应的稀释倍数);1000:单位转化系数,1 μg=1000 ng。
3. 血清样本
吡哆醛的含量(μg/mL)= x ×V 提取÷V 样本×F÷1000=0.002x×F
V 提取:提取液总体积,1 mL(0.5mL 血清+0.1mL 提取液+0.1mL 试剂一+0.3mL 蒸馏水);V
样本:加入样本体积,0.5 mL;F:样本稀释倍数(稀释后测试的样本,计算时需要乘以相应的稀释倍数);1000:单位转化系数,1 μg=1000 ng。
注意事项
1. 本试剂盒的提取液中含有不溶物,需摇匀后使用。
2. 测试完毕后,需要用高浓度的超纯水相冲洗色谱柱(约 20-30 个柱体积),以防阻塞色谱柱,再用高浓度的有机相冲洗色谱柱,最 后按柱子的种类规范冲洗,防止损伤色谱柱。
3. 标准品的稀释倍数要根据样品中吡哆醛的浓度确定,样品中吡哆醛的峰面积必须在不同浓度的标准品溶液的峰面积之内,该标准品的稀释倍数只是一个参考。若样本中吡哆醛浓度过高,建议用蒸馏水稀释后再测。
4. 若样本量过大,建议每天测试一次标准溶液(一个浓度的标准溶液即可),以确定相应的保留时间,待测溶液测试前须放置至室温状态。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!