产品详情
硝酸还原酶(NR)活性检测试剂盒(Griess 显色法)说明书
微量法
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 诱导液:将诱导剂储备液用蒸馏水 10 倍稀释后使用,即取 10 mL 诱导剂储备液加 90 mL 蒸馏水,充分混匀。现配现用。
2、 试剂二:加入 1mL 蒸馏水,-20℃分装保存,可以-20℃保存 2 周。临用前用蒸馏水将试剂二稀释 50 倍,备用,即取 10 μL 试剂二加入 490 μL 蒸馏水混匀。
3、 标准品:10 μmol/mL 亚硝酸钠标准溶液。临用前将用蒸馏水标准溶液稀释 100 倍得到 0.1 μmol/mL 的亚硝酸钠标准液,备用。
产品说明:
NR(EC 1.7.1.3)广泛存在于植物中,是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶,也是诱导酶,对作物的产量和品质有影响。NR 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐,NO3ˉ +NADH+H+→NO2ˉ+NAD++H2O。在酸性条件下,产生的NO2ˉ能够参与重氮化反应生成紫红色化合物,这种紫红色化合物在 540 nm 处有吸收峰,540 nm 下吸光值的变化即可表示酶活。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织前处理:
(1) 取适量诱导液于烧杯中,将新鲜标本洗净,滤纸吸干,放入诱导液中(淹没即可),避光浸泡 2 h,取出样本,滤纸吸干后,-20℃冷冻 30 min,取出样本,滤纸吸干。(根据需要进行诱导处理,一般不需要诱导处理,预实验结果没有活性则需要进行诱导处理)
(2) 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(称取约 0.1 g 样本,加入 1 mL 提取液),冰浴研磨,8000g,4℃离心 10 min,取上清置冰上待测。
2、细胞或细菌的前处理:
先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计/酶标仪预热30 min以上,调节波长至540 nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定:
(2) 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(称取约 0.1 g 样本,加入 1 mL 提取液),冰浴研磨,8000g,4℃离心 10 min,取上清置冰上待测。
2、细胞或细菌的前处理:
先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计/酶标仪预热30 min以上,调节波长至540 nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定:
三、NR活性计算
NR 活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
酶活定义:每小时每 mg 组织蛋白催化产生 1 μmol NO2-的量为 1 个 NR 活力单位。
NR 活力(U/mg prot)= C 标准×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)×V 样本÷(V 样本×Cpr)÷T×F
= 0.2×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷Cpr×F
(2)按样本质量计算:
酶活定义:每小时每 mg 组织催化产生 1 μmol NO2-的量为 1 个 NR 活力单位。
NR 活力(U/g 质量)=C 标准×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)×V 样本÷(W×V 样本÷V 提取)÷T×F
= 0.2×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W×F
(3)按细胞数量计算:
酶活定义:每小时每 1 万个细胞或细菌催化产生 1 μmol NO2-的量为 1 个 NR 活力单位。
NR 活力(U/104 cell)
=C 标准×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)×V 样本÷(细胞或细菌数量×V 样本÷V 提取)÷T×F
= 0.2×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷细胞或细菌数量×F
C 标准:亚硝酸钠标准溶液浓度,0.1 μmol/mL;V 提取:加入提取液体积,1 mL;W:样本质量,g;T:反应时间,0.5 h;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V 样本:加入的样本体积,0.02 mL;细胞或细菌数量:以万计;F:样本稀释倍数。
注意事项:
1. 吸光度大于 1 时,建议用提取液稀释样本,注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。
2. 严格按照样本测定表格列出顺序加入试剂进行实验。
实验实例:
1. 取 0.1 g 绿萝叶片加入 1 mL 提取液进行匀浆研磨,离心取上清按照测定步骤操作,用 96 孔板测得 A 测定=0.078、A 对照=0.070、A 标准=0.268、A 空白=0.046,按样本质量计算酶活得:
NR 活力(U/g 质量)= 0.2×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W= 0.0721 U/g 质量。
2. 取 0.1 g 洋桔梗叶片加入 1 mL 提取液进行匀浆研磨,离心取上清按照测定步骤操作,用 96 孔板测得 A 测定=0.088、A 对照=0.064、A 标准=0.268、A 空白=0.046,按样本质量计算酶活得:
NR 活力(U/g 质量)= 0.2×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W= 0.216 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!