耶氏肺孢子虫探针法荧光定量PCR试剂盒

【产品名称】

英文名称：Pneumocystis jirovecii  PCR Kit

中文名称：耶氏肺孢子虫探针法荧光定量PCR试剂盒

【包装规格】

50T/盒

【预期用途】

肺孢子虫(Pneumocystis)是一种重要的机会致病性病原体，寄生于人和多种哺乳动物肺组织内，引起肺孢子虫肺炎(Pneumocystis pneumonia,PCP)或称肺饱子虫病(Pneumocystosis)。目前将寄生于鼠类的称为耶氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii) ，寄生人体者称为耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jiroveci)。该虫可在免疫功能低下的人群中诱发致命性的肺孢子虫肺炎(PCP)。本本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测耶氏肺孢子虫的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据耶氏肺孢子虫高度保守区设计，不会跟其他病原 DNA发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，针对耶氏肺孢子虫的基因高度保守区域设计特异性引物，用荧光 PCR 技术对耶氏肺孢子虫的核酸进行体外扩增检测，在反应体系中含耶氏肺孢子虫核酸模板的情况下，PCR 反应得以进行并释放荧光信号，利用仪器对 PCR 过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。

【试剂组成】

备注：1）不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 7 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

自备：无 DNA/RNA酶的 1.5mL 离心管，0.2mLPCR反应管，滤芯吸头(规格:10μL，200μL，1000μL)，离心机，振荡混合器，各种规格的移液器。

【样品要求】

1. 根据实际情况，病死或扑杀的牛，无菌剪取肠道等样品，活畜取全血、血清血浆、粪便、呕吐物、口腔鼻咽呼吸道分泌物、咽喉部鼻孔眼部和肛门拭子和病毒培养物作为检测样本。

2. 应避免样本间交叉污染，样本采集后应及时检测，也可保存于-20±5℃待检，长期保存应置于-70℃以下。

【样品保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

按照试剂盒操作说明或者微生物样品处理方法做好样品前处理。

1.2 DNA 提取

根据您实验室的具体情况和样品类型，选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠，我们建议使用商品化的试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明书进行操作，样本核酸提取过程中应避免污染，提取好的模板样品如不能立即检测，建议-15℃以下保存。

推荐采用我们公司研发生产的试剂盒：Hypure 病毒基因组 DNA 提取试剂盒

2. 试剂配制（试剂准备区）

2.1 从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温（20～25℃），注意避免强光照射，待完全溶解后振荡混匀并低速离心 10 s，使用低吸附吸头分液取样，避免试剂损失和浪费。

2.2 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

2.3 在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后 2000 rpm 离心 10 s，按照 20 μL/管分装量将试剂分装至八联 PCR 反应管中。

2.4 盖紧八联 PCR 反应管盖, 并注意做好相应标识（请标记在八联 PCR 反应管盖两端突出部位，切勿标记在八联 PCR 反应管盖中间，以免影响信号采集）。将 PCR 反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1.2 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心，核酸加样过程中应避免污染。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内, 并记录放置顺序。

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25 μL；

荧光通道选择：检测通道选择 FAM， 淬灭通道选择 NONE，参比荧光选 NONE。

4.4 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现 Ct 值≤38.0 和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：检测结果 Ct 值无 Ct 值，无明显的扩增曲线。

6. 质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤30；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7. 产品性能指标

阴阳性参考品符合率：5 份阳性参考品符合率为 100％；10 份阴性参考品符合率为 100％。

最低检测限：1.0×103copies/mL。

精密度：批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数（CV）均小于等于 3%。

8. 检测方法的局限性

样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

9. 注意事项

所有操作严格按照说明书进行；

试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

反应液应避光保存；

反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！