产品详情
大森林埃博拉病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
【产品名称】
中文名称:大森林埃博拉病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
英文名称:Tai Forest Ebola Virus(TAFV) RT-PCR Kit
【包装规格】
50T/盒
【检验原理】
本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术,设计一对大森林埃博拉病毒(TAFV)特异性引物,结合一条特异性探针,用一步法荧光RT-PCR技术对大森林埃博拉病毒(TAFV)的核酸进行体外扩增检测。
【包装规格及成分】
编号 | 成分 | 规格 |
试剂一 | TAFV扩增液 | 50μL×1管 |
试剂二 | TAFV反应液 | 950uL×1管 |
试剂三 | TAFV阳性质控品(5.59E+04) | 50μL×1管 |
试剂四 | TAFV阴性质控品 | 50μL×1管 |
产品说明书 | 1份 | |
注: 1) 不同批号的试剂盒组分不可交互使用。 2) 试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。 3) 自备:无DNA/RNA酶的1.5mL离心管,0.2mL PCR反应管,滤芯吸头(规格:10μL,200μL,1000μL),离心机,振荡混合器,各种规格的移液器。 4) 禁止与其他品牌/自配的试剂混用,否则会影响使用效果。 |
【储存条件及有效期】:
1.试剂盒应置于-15℃以下冷冻避光储存;有效期12个月,采用泡沫盒加生物冰袋密封运输,温度不超过8℃,生产日期及有效期详见外包装盒。
2.试剂盒避免反复冻融,冻融次数不超过5次,开封后-15℃以下冷冻避光储存,不影响有效期内使用。
【适用仪器】:
ABI、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。
【标本采集】:
1.根据实际情况可采取病毒/组织/血液等样品1g作为检测样本
2.应避免样本间交叉污染,样本采集后应及时检测,也可保存于-20±5℃待检,长期保存应置于-70℃以下。
【样本保存及运输】:
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过6个月,标本运送应采用2~8℃冰袋运输,严禁反复冻融。
【使用方法】:
1.样品处理(样本处理区)
1.1样本前处理
1)组织样品:每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g,手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中,8000rpm离心2min,取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中;
2)全血样本:待血凝固后,取血清100μL于1.5mL灭菌离心管中。
1.2核酸(RNA)提取
根据您实验室的具体情况和样品类型,选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠,我们建议使用商品化病毒DNA/RNA提取试剂盒进行提取,严格按照对应试剂盒说明书进行操作,样本核酸提取过程中应避免污染,提取好的模板样品如不能立即检测,建议-15℃以下保存。
推荐采用我们公司研发生产的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒
2.试剂配制(试剂准备区)
2.1从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温(20~25℃),注意避免强光照射,待完全溶解后振荡混匀并低速离心10 s,使用低吸附吸头分液取样,避免试剂损失和浪费。
2.2根据待检测样本总数,设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照;样品每满7份,多配制1份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 | TAFV反应液 | TAFV扩增液 |
用量(样本数为N) | 19μL | 1μL |
2.3在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂,充分振荡混匀后2000 rpm离心10 s,按照20μL/管分装量将试剂分装至八联PCR反应管中。
2.4盖紧八联PCR反应管盖,并注意做好相应标识(请标记在八联PCR反应管盖两端突出部位,切勿标记在八联PCR反应管盖中间,以免影响信号采集)。将PCR反应管转移至样本准备区,剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。
3.加样(样本处理区)
将步骤1.2提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心,核酸加样过程中应避免污染。
4.PCR扩增(核酸扩增区)
4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内,并记录放置顺序;
4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为25μL;
4.3荧光通道选择:检测通道选择FAM,淬灭通道选择NONE,参比荧光选NONE。
【推荐循环参数设置】:
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 50℃ | 15min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 3min | 否 |
40 cycles | 95℃ | 15sec | 否 | |
55℃ | 30sec | 是 |
5.【结果分析判断】
5.1结果分析条件设定
设置Baseline和Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节),以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
5.2结果判断
1)阳性:检测通道Ct值≤35.0,且曲线有明显的指数增长曲线。
2)可疑:检测通道Ct值>35.0,且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验,重复试验结果出现Ct值≤38.0和典型扩增曲线者为阳性,否则为阴性。
3)阴性:检测结果Ct值无Ct值,无明显的扩增曲线。
6.【质控标准】
1)阴性质控品:无明显扩增曲线或无Ct值显示;
2)阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且Ct值≤30;
3)以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
7.【产品性能指标】
1)阴阳性参考品符合率:5份阳性参考品符合率为100%;10份阴性参考品符合率为100%。
2)最低检测限:1.0×103copies/mL。
3)精密度:批内、批间精密度检测Ct值的变异系数(CV)均小于等于3%。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!