莱氏无胆甾原体染料法荧光定量PCR试剂盒

【产品名称】

英文名称：Acholeplasma laidlawii

中文名称：莱氏无胆甾原体染料法荧光定量PCR试剂盒

【包装规格】

50T/盒

【预期用途】

莱氏无胆甾原体属于柔膜体纲，支原体目，无胆甾原体科，无胆甾原体属。莱氏无胆甾原体最初分离自污水、肥料、腐土质、土壤和植物组织，后来人们发现在牛生殖道和鼻腔、猪鼻腔、人口腔、鸡窦等各种哺乳动物和鸟类中均发现其寄生现象。莱氏无胆甾原体也是常见的污染细胞的支原体之一。荧光定量 PCR 是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测莱氏无胆甾原体的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据莱氏无胆甾原体高度保守区设计，不会跟其他病原DNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

【检验原理】

本试剂盒采用SYBR Green 染料法实时荧光 PCR 技术，针对莱氏无胆甾原体的基因高度保守区域设计特异性引物，用荧光 PCR 技术对莱氏无胆甾原体的核酸进行体外扩增检测，在反应体系中含莱氏无胆甾原体核酸模板的情况下，PCR 反应得以进行并释放荧光信号，利用仪器对 PCR 过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。

【试剂组成】

说明：1）不同批号的试剂盒组分不可交互使用。2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 7 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

自备：无 DNA/RNA 酶的 1.5mL 离心管，0.2mL PCR 反应管，滤芯吸头(规格:10μL，200μL，1000μL)，离心机，振荡混合器，各种规格的移液器。

【样品要求】

1. 根据实际情况采样，胃液分泌物、胃液呕吐物以及样品培养物作为检测样本，具体参考《临床微生物样本采集规范》。

2. 应避免样本间交叉污染，样本采集后应及时检测，也可保存于-20±5℃待检，长期保存应置于-70℃以下。

【样品保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

按照试剂盒操作说明或者临床样品处理方法做好样品前处理。

1.2 DNA 提取

根据您实验室的具体情况和样品类型，选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠，我们建议使用商品化的试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明书进行操作，样本核酸提取过程中应避免污染，提取好的模板样品如不能立即检测，建议-15℃以下保存。推荐采用我们公司研发生产的试剂盒：细菌基因组 DNA 提取试剂盒(离心柱法)

2. 试剂配制（试剂准备区）

2.1 从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温（20～25℃），注意避免强光照射，待完全溶解后振荡混匀并低速离心 10 s，使用低吸附吸头分液取样，避免试剂损失和浪费。

2.2 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

2.3 在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后 2000 rpm 离心 10 s，按照 20 μL/管分装量将试剂分装至八联 PCR 反应管中。

2.4 盖紧八联 PCR 反应管盖, 并注意做好相应标识（请标记在八联 PCR 反应管盖两端突出部位，切勿标记在八联 PCR 反应管盖中间）。将 PCR 反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心，核酸加样过程中应避免污染。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内。

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25 μL。

荧光通道选择：检测通道荧光染料法(SYBR Green I)， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3 推荐循环参数设置：

5. 结果分析判定

5.1 结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2 结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。

可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现 Ct 值≤38.0 和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。

阴性：检测结果 Ct 值无 Ct 值，无明显的扩增曲线。

6. 质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤30；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7. 产品性能指标

阴阳性参考品符合率：5 份阳性参考品符合率为 100％；10 份阴性参考品符合率为 100％。

最低检测限：1.0×103copies/mL。

精密度：批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数（CV）均小于等于 3%。

8. 检测方法的局限性

Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

Ø 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

9. 注意事项

Ø 所有操作严格按照说明书进行；

Ø 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

Ø 反应液应避光保存；

Ø 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

Ø 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

Ø 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

Ø 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

Ø 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！