[样品制备]
当使用抗凝外周血或血沉棕黄层时,应通过密度梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。
▲注意:密度梯度分离后去除血小板:将细胞沉淀重悬于缓冲液中,在200°C下以10×g离心15−20分钟。 小心地除去上清液。重复洗涤步骤并小心地除去上清液。
处理组织时,通过标准制备方法制备单细胞悬液。
▲ 注意:死细胞可能与微珠非特异性结合。要去除死细胞,我们建议使用密度梯度离心或死细胞去除试剂盒。
[磁性标签]
▲ 快速工作,保持细胞低温,并使用预冷溶液。这将防止抗体在细胞表面封顶和非特异性细胞标记。
▲ 下面给出的磁性贴标体积最多为107总细胞数。使用少于 10 个时7单元格,使用与指示相同的体积。当使用较高数量的细胞时,相应地扩大所有试剂体积和总体积(例如,2×107总细胞数,使用所有指示试剂体积和总体积的两倍)。
▲ 为了获得最佳性能,在磁分离之前获得单细胞悬液非常重要。将细胞通过30μm尼龙网(预分离过滤器)以去除可能堵塞色谱柱的细胞团块。
1. 确定细胞数。
2.将细胞悬液以300×g离心10分钟。完全移取上清液。
3. 每 80 次将细胞沉淀重悬于 10 μL 缓冲液中7总细胞数。
4. 每 20 个添加 3 μL CD10 微珠7总细胞数。
5.充分混合并在15-2°C下孵育8分钟。
▲ 注意:在冰上工作可能需要增加孵育时间。更高的温度和/或更长的孵育时间会导致非特异性细胞标记。
6.(可选)添加染色抗体,例如加入 10 μL CD3-FITC并在 5−2 °C 下孵育 8 分钟。
7. 每 1 次加入 2−10 mL 缓冲液洗涤细胞7细胞并以300×g离心10分钟。完全移取上清液。
8. 最多重悬 10 个8细胞在 500 μL 缓冲液中。
▲ 注意:对于更高的细胞数量,请相应地增加缓冲液体积。
▲ 注:对于LD柱的耗尽,重悬至1.25×108细胞在 500 μL 缓冲液中。
9. 进行磁选。
[磁选]
▲ 根据总细胞数和CD3细胞数选择合适的MACS色谱柱和MACS分隔符 。+
使用 MS 或 LS 色谱柱进行磁分离
1. 将色谱柱置于合适的 MACS 分离器的磁场中。
2.用适量的缓冲液冲洗制备色谱柱:
质谱:500 微升 LS:3 毫升
3.将细胞悬液涂在色谱柱上。
4.收集通过的未标记细胞,并用适量的缓冲液洗涤色谱柱。通过添加缓冲液三次来执行洗涤步骤,每次在色谱柱储液槽为空后。
质谱:3× 500 μL LS:3× 3 mL
收集全部污水。这是未标记的细胞部分。
5.从分离器中取出色谱柱并将其放在合适的收集管上。
6. 将适量的缓冲液移液到色谱柱上。通过牢固地应用色谱柱随附的柱塞,立即用磁性标记的细胞冲洗出馏分。
质谱:1 毫升 LS:5 毫升
▲ 注意:为了增加磁性标记馏分的纯度,可以将其通过新鲜制备的新色谱柱。
使用 XS 色谱柱进行磁分离
有关色谱柱组装和分离的说明,请参阅“XS色谱柱数据手册”。
LD色谱柱的耗尽
1. 将LD柱放置在合适的MACS分离器的磁场中。
2. 用 2 mL 缓冲液冲洗制备色谱柱。
3.将细胞悬液涂在色谱柱上。
4.收集通过的未标记细胞并用2×1 mL缓冲液洗涤色谱柱。收集全部污水。这是未标记的细胞部分。
CS色谱柱的耗尽
1. 组装 CS 色谱柱并将其放置在合适的 MACS 分离器的磁场中。
2. 通过填充并用 60 mL 缓冲液冲洗来制备色谱柱。将 22G 流量电阻器连接到组装柱的 3 路旋塞阀上。
3.将细胞悬液涂在色谱柱上。
4.收集通过的未标记细胞,并从顶部用30 mL缓冲液洗涤色谱柱。
收集全部污水。这是未标记的细胞部分。
使用 autoMACS 分离器进行磁分离
▲ 请参考《自动 MACS 用户手册》,了解如何使用 autoMACS 分隔符。
1. 准备并启动自动 MACS 分隔符。
2. 将装有磁性标记细胞的管子放入 autoMACS 分离器中。对于标准分色,请选择以下分色程序:
正向选择:“波塞尔”
耗尽:“耗尽”
▲ 注:程序选择取决于隔离策略、磁性标记的强度和磁性标记单元的频率。有关详细信息,请参阅 autoMACS 用户手册:“autoMACS 细胞分离程序”。
3.使用“Possel”程序时,收集正分数(出口端口“pos1”)。这是
纯化的CD3细胞部分。+
使用程序“耗尽”时,收集未标记的分数(出口端口“neg1”)。这是CD3细胞部分。