1. 将分离所用的缓冲液与本品均恢复至室温。
2. 用离心管收集血液,并与等量的生理盐水,Hanks 液或不含钙镁的PBS 混匀(血液不稀释亦可)。
3. 取15mL 离心管,加入3mL 本品,并将2 步骤中的稀释血液缓缓铺加到本品的上层。注意:铺加血样时建议速度适中,尤其是刚开始时的铺加, 避免破坏淋巴细胞分离液与血样的界面。
4. 室温下,800g 离心20min。
5. 离心后,离心管由上到下分为4 层:血浆层-白膜层-人淋巴细胞分离液层-红细胞与粒细胞的沉淀。不用弃去上层液体, 用巴斯德管小心吸取白膜层至另一新的离心管中。
注意:由于样本之间的差异,有的血样离心后,仍有部分的红细胞以及粒细胞残留在分离液层中,无法沉淀完全,因此用巴斯德管吸取白膜层的细胞时,尽量少吸取到分离液层中的液体。
6. 用10mL生理盐水,Hanks 液或不含钙镁的PBS重悬获得的PBMC,300g,离心10min。
7. 重复操作步骤 6 一次,沉淀即为 PBMC。