产品详情
Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)基于Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase而开发的即用型预混液。与Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase相比,Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase热稳定性大幅度提高,可耐受高达60℃的反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时,该酶增强了与模板的亲和力,非常适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。
该预混液包含5×gDNA digester Mix和4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus。5×gDNA digester Mix可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染,保证后续结果更加可靠。4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus 含有逆转录反应所需的所有组分(Buffer,dNTP,Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase,RNase inhibitor,Random primers/ Oligo (dT)18 primer mix),只需加入RNA模板和 RNase-free H2O即可进行逆转录反应,并同时终止gDNA digester的作用,保证cDNA的完整性。
该产品适用于两步法RT-qPCR检测,针对qPCR进行特别优化,比例优化的Random primers/ Oligo (dT)18 primer mix,使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始,并具有相同的逆转录效率,最大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。逆转录产物兼容SYBR® Green和探针法qPCR,可以根据实验目的,选择Hieff UNICON® qPCR SYBR® Green Master Mix,Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix或Hieff® qPCR TaqMan Probe Master Mix等试剂配合使用,进行高性能的基因表达分析。
产品组分
组分编号 | 组分名称 | 产品编号/规格 | |
11141ES10 (10 T) | 11141ES60 (100 T) | ||
11141-A | RNase-free H2O | 1 mL | 2×1 mL |
11141-B | 5×gDNA digester Mix | 30 μL | 320 μL |
11141-C | 4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus | 50 μL | 500 μL |
【注】:4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus含有gDNA digester抑制剂。
产品应用
适用于两步法RT-qPCR。
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃保存。有效期18个月。
注意事项
1)5×gDNA digester Mix和4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus含有高浓度的甘油,使用前请短暂离心收集到反应管底部,并用移液枪轻轻吸打充分混匀后,准确吸取;
2)如果加入RNA模板体积较大 (如超过2 μL),请确保RNA是溶于水中而不是TE中,因为TE会对gDNA去除以及逆转录反应产生抑制;
3)可以不经过基因组去除步骤,直接用4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus进行逆转录,这样所得到的结果会与使用Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (Cat No.11137ES) 效果一致。但是请勿将gDNA digester与11137ES中的Hifair® Ⅲ SuperMix配套使用,因其不含终止gDNA digester反应的成分,会影响反转录和后续的qPCR实验;
4)反应液的配制应在冰上操作完成,操作过程应避免RNase污染;
5)为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作;
6)本产品仅作科研用途!
第一链cDNA合成操作步骤
1. 残留基因组DNA去除
在RNase free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。
组分 | 使用量 |
RNase-free H2O | To 15 μL |
5×gDNA digester Mix | 3 μL |
Total RNA or mRNA | 10 pg -5 μg* 10 pg-500 ng* |
【注】:* 20 μL逆转录反应体系建议Total RNA的投入量不超过1 μg。如果目的基因的表达丰度低,最多投入5 μg Total RNA,否则RNA投入量过高,可能会超过后续定量PCR的线性范围。
2. 逆转录反应体系配制(20 μL体系)
在第1步的反应管中直接加入4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus,用移液器轻轻吹打混匀。
组分 | 使用量 |
第1步的反应液 | 15 μL |
4×Hifair® Ⅲ SuperMix plus | 5 μL |
3.逆转录标准程序设置
温度 | 时间 |
25℃ | 5 min |
55℃ | 15 min |
85℃ | 5 min |
【注】:逆转录温度:推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板,可将逆转录温度提高到60℃。
逆转录快速程序设置
温度 | 时间 |
55℃ | 15 min |
85℃ | 5 sec |
【注】:逆转录快速程序适用于中低GC含量(≤55%)或者简单模板。
※ 逆转录产物可立即用于qPCR反应,也可-20℃短期保存,若需长期保存,建议分装后,于-80℃保存,避免反复冻融。
HB221101