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pBM26 Toposmart Cloning Kit(gateway系统入门 TOPO克隆载体)
商品属性:
货号 | 规格 | 产品名称 |
P-PR1206-20 次 | 20 次 | pBM26 Toposmart Cloning Kit(gateway系统入门 TOPO克隆载体) |
产品介绍:
保存条件:-20℃保存
产品介绍:
利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将PCR产物定向克隆到线性化的pBM26载体中。适用于克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物。pBM26载体类似于invitrogen公司的pENTR/D-TOPO入门载体,具有attL1和attL2,为gateway系统中的入门载体。引物M13F(-21)r和M13R可用于菌落PCR和测序鉴定。
产品特点:
(1) 连接反应仅需 5 分钟。
(2) 只适合平末端 PCR 产物的快速、高效、定向克隆。
(3) 载体采用了新的制备工艺,零背景,无需蓝白斑筛选
(4) 可在基因的 C 端中融合 Flag 标签序列。
(5) 载体为卡那霉素抗性。
注意事项:
(1) 引物要求:PCR 引物 5’端不能进行磷酸化修饰,普通商业化引物即可。上游引物的 5’端添加 CACC 四个碱基(CACC 为真核表达所必需的Kozak 序列)。如果目的蛋白需要在 C 端带 FLAG 标签,下游引物则需要去掉基因本身的终止密码子(3 个碱基),目的蛋白的翻译终止由 FLAG 标签的终止密码子 TAA(位于 Xho I 酶切位点前)来实现。
(2) DNA 聚合酶:选用 Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和 Xerox 等高保真 DNA 聚合酶用于 PCR 扩增。
(3)连接时间:5-15 分钟,一般为 15 分钟。
(4)连接温度:室温 (22℃-30℃),可使用PCR仪控温。最佳反应温度为25℃。若片段有高GC等复杂结构,可在37℃反应。
(5)产物要求:为保证PCR产物完整,建议72℃后延伸5-10分钟。连接前使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量和纯度,如PCR产物为非单一性条带,目的片段一定要切胶回收。如PCR产物为单一条带,无引物二聚体,可以取1-3?l的PCR产物直接连接。但若扩增模板为质粒DNA,应注意质粒的抗性。由于pBM26载体为卡那抗性,以氨苄抗性的模板质粒扩增的PCR产物直接连接后的产物可涂布在卡那抗性的LB平板上。以卡那抗性的模板质粒扩增的PCR产物应切胶回收后再连接。
(6)片段用量:胶回收的DNA片段一般使用量为50-100ng。对照片段为5’端带CACC四个碱基的全长EGFP基因的平末端产物。
(7)在M13F(-21)和M13R引物干粉管中加120?l灭菌水即为5?M浓度的引物。
pcr相关试剂实验结果分析:
PCR实验结果的分析涉及多个方面,包括实验操作、试剂质量、实验条件等,这些因素都会影响PCR实验的成功率和结果的准确性。以下是对PCR实验结果分析的一些关键点:
循环次数过多:增加模板量减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间,或改用两种温度的PCR循环,可以有效避免循环次数过多导致的问题。
退火温度过低:退火温度的适当调整对于PCR反应的成功至关重要,过低的退火温度可能导致非特异性扩增,影响结果的准确性1。
电泳体系问题:包括凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大、凝胶没有凝固好、琼脂糖质量差等问题,这些都会影响DNA片段的分离效果。
试剂盒问题:运输储存不当可能引起试剂盒失效,试剂盒本身质量问题如引物选择、循环参数设置不当也可能导致实验失败1。
降解的陈旧模板:使用降解的陈旧模板进行扩增容易产生涂布,影响结果的解读1。
PCR假阴性结果:可能由引物长度不够、试剂浓度不标准、靶序列突变或缺失、循环参数设置错误、标本中有Taq酶抑制剂、PCR产物检测系统灵敏度不够等因素引起。
为了获得准确的PCR实验结果,需要注意以下几点:
确保PCR反应体系中各种试剂的配比和操作步骤的精准度。
在PCR反应过程中需要对PCR产物进行实时监测,以便及时对反应条件进行调整。
防止样本的污染和交叉感染,以免影响PCR反应的准确性和可靠性。
通过上述分析,可以更好地理解和控制PCR实验中的关键因素,从而提高实验结果的准确性和可靠性。
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