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pBM28 Toposmart 克隆试剂盒
商品属性:
货号 | 规格 | 产品名称 |
P-PR1213-20 次 | 20 次 | pBM28 Toposmart 克隆试剂盒 |
产品介绍:
保存条件:-20℃保存。
产品介绍:
利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将PCR产物定向克隆到线性化的pBM28载体中。适用于克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5 等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物。pBM28 载体类似于公司的pENTR/D-TOPO入门载体, 具有attL1 和attL2,为gateway系统中的入门载体。引物M13F(-21)和M13R可用于菌落PCR和测序鉴定。
产品特点:
(1)连接反应仅需 5 分钟。
(2)只适合平末端 PCR 产物的快速、高效、定向克隆。
(3)载体采用了新的制备工艺,零背景,无需蓝白斑筛选。
(4)与pBM27载体相比,pBM28载体无标签序列。
(5)载体为壮观霉素抗性。
注意事项:
(1)引物要求:PCR 引物5’端不能进行磷酸化修饰,普通商业化引物即可。上游引物的5’ 端添加CACC 四个碱基(CACC 为真核表达所必需的Kozak 序列)。
(2)DNA 聚合酶:选用Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和Xerox 等高保真DNA 聚合酶用于PCR 扩增。
(3)连接时间:5-15 分钟,一般为 15 分钟。
(4)连接温度:室温 (22℃-37℃),可使用PCR仪控温。最佳反应温度为25℃。若片段有高GC等复杂结构,可在37℃反应。
(5)产物要求:为保证PCR产物完整,建议72℃后延伸5-10分钟。连接前使用琼脂糖凝
pcr相关试剂实验结果分析:
PCR实验结果的分析涉及多个方面,包括实验操作、试剂质量、实验条件等,这些因素都会影响PCR实验的成功率和结果的准确性。以下是对PCR实验结果分析的一些关键点:
循环次数过多:增加模板量减少循环次数,缩短退火时间及延伸时间,或改用两种温度的PCR循环,可以有效避免循环次数过多导致的问题。
退火温度过低:退火温度的适当调整对于PCR反应的成功至关重要,过低的退火温度可能导致非特异性扩增,影响结果的准确性1。
电泳体系问题:包括凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大、凝胶没有凝固好、琼脂糖质量差等问题,这些都会影响DNA片段的分离效果。
试剂盒问题:运输储存不当可能引起试剂盒失效,试剂盒本身质量问题如引物选择、循环参数设置不当也可能导致实验失败1。
降解的陈旧模板:使用降解的陈旧模板进行扩增容易产生涂布,影响结果的解读1。
PCR假阴性结果:可能由引物长度不够、试剂浓度不标准、靶序列突变或缺失、循环参数设置错误、标本中有Taq酶抑制剂、PCR产物检测系统灵敏度不够等因素引起。
为了获得准确的PCR实验结果,需要注意以下几点:
确保PCR反应体系中各种试剂的配比和操作步骤的精准度。
在PCR反应过程中需要对PCR产物进行实时监测,以便及时对反应条件进行调整。
防止样本的污染和交叉感染,以免影响PCR反应的准确性和可靠性。
通过上述分析,可以更好地理解和控制PCR实验中的关键因素,从而提高实验结果的准确性和可靠性。
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