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产品名称：俄罗斯春夏脑炎病毒RT-PCR试剂盒

本产品就是根据PCR原理专门开发的试剂盒，它具有下列特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2.引物等组分经过优化，灵敏度高。

3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.特异性高，引物是根据高度保守区设计，不会跟其他的DNA/RNA发生交叉反应。

5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6.本产品足够50次20μL体系的染料法荧光定量PCR反应。

俄罗斯春夏脑炎病毒RT-PCR试剂盒使用方法

一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。

2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。

4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、DNA提取：

可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。

1、液体培养物：取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。

2、固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。

3、粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。

4、其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。

盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

注意：循环次数不要超过 35 个循环。

俄罗斯春夏脑炎病毒RT-PCR试剂盒样本采集、存放及运输：

1、样本采集：各类型样本按照常规方法采集；

2、运输及保存：低温运输，-20v℃保存，保存期限一年。阳性对照需单独放置，不要污染其他试剂。

3、运输：采用泡沫箱加冰密封进行运输。

4、自备试剂：样品DNA。

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