兔子游离脂肪酸

实验目的：

本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中兔子游离脂肪酸(FFA)的含量

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定大鼠标本中兔子游离脂肪酸(FFA)水平。用纯化的兔子游离脂肪酸(FFA)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入兔子游离脂肪酸(FFA)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的兔子游离脂肪酸(FFA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中兔子游离脂肪酸(FFA)含量。

试验所需自备物品:

1.  酶标仪(450nm波长滤光片)

2.  37℃恒温箱，双蒸水或去离子水

3.  自动洗板机

4.  高精度移液器， EP管及一次性吸头： 0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

5. 吸水纸

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检测程序:

1. 加样：空白孔加入50μl标准品/样品稀释液，其余孔各加入标准品或待测样品50ul，将反应板混匀后置37℃，40分钟。

2. 洗板：用1×洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，每孔加入1×洗液350μl，每次震荡/浸泡1-2分钟，向滤纸上印干。

3. 空白孔加入100ul生物素化抗体稀释液，其余孔各加入1×的生物素化抗体工作液100ul，混匀后置37℃，30分钟。

4. 洗板：同上。

5. 每孔加入SABC复合物工作液100ul，混匀后置37℃，20分钟。

6. 洗板：同上。

7. 每孔加入提前配置好的TMB混合液100ul，混匀后置37 ℃暗处反应10-20分钟（具体显色时间根据显色结果而定）。

8. 每孔加入100ul终止液，混匀，30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果判断与计算：

1. 所有OD值建议减除空白值后再行计算，如空白OD低于0.1，也可以直接计算。

2. 以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，手工绘制或用软件绘制标准曲线，根据样品OD值计算出相应含量，再乘上稀释倍数即可。

试剂盒性能:

1、 检测范围:0.625-40ng/mL

2、 特异性:同时可检测重组或天然的某种蛋白或抗体，不与其它细胞因子有交叉反应。

3、 重复性:板内，板间变异系数均小于10%。

操作步骤:  

1.加样→2.温育→3.配液→4.洗涤→5.加酶→6.温育→7.洗涤→8.显色→9.加终止→10.测定。

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2． 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，每个标准品和空白孔建议做复孔，每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3． 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体，盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4． 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次，如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5． 每孔加入50ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6． 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次，如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7． 每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8． 取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9． 在450nm波长处测定各孔的OD值。

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