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多光子显微是一种对高散射活体生物厚样品成像的有效手段。MPM200系列多光子显微镜代表了用于各种成像需求的一种理想平台。这些系统能够胜任小如生物组织、大如整个活体生物的样品成像。MPM200多光子显微镜能够为宽场透射光显微、epi荧光成像和精细多光子技术提供通用的解决方案， 从而最精细地将您的数据还原出来。Thorlabs提供从物镜到抗振工作台的全系列产品，使您可以根据您的成像需求和预算构建最理想的系统。
当同时到达的两个（或更多）光子的能量和足以激发一个荧光团，便会产生多光子激发。与共聚焦显微镜相比，多光子显微镜使用近红外光在可见光范围内激发荧光团的方法可在更深的组织内成像。此外，由于信号光在空间上局限在物方焦平面，无需共聚焦针孔来产生光学切片图像，这样大大提高了探测的灵敏度。信号产生的空间限制也降低了整体的光漂白。这些优势使得多光子显微镜成为在活体组织内长时间深度成像的理想选择。
- 灵活的用户自定义系统 – 提供完整的多光子系统，其灵活性使其成为您成像应用的理想选择。
- 宽带激发 - 680 - 1400纳米的激发光范围覆盖了各种荧光团。
- 高扫描速度 - 30帧每秒的扫描速度可以对动态生物过程进行快速成像，并且能减少损伤和光漂白。
- 直观的图像采集软件 – ThorlabsLS软件完全集成在系统中，可以控制所有硬件，包括用于三维成像的Z轴步进电机。
- 全视场非退扫描探测器 - 高灵敏度，更低的激光功率，成像更深。
规格
| Microscope | |
|---|---|
| Stand | Upright Nikon FN1 |
| Recommended Objectives |
Nikon CFI LWD 16XW, 0.80NA,WD 3.0 mm; Nikon CFI Apo 25XW, 1.10NA,WD 2.0 mm; Nikon CFI Apo Lambda S LWD 40XW, 1.15NA,WD 0.61 mm; Nikon CFI Apo Lambda S 40XW, 1.25NA,WD 0.18 mm; Nikon CFI Plan Apochromat 60XW, 1.20NA,WD 0.27mm; Olympus XLUMPLFLN 20XW, 1.0NA,WD 2.0 mm, Nikon AZ PlanFluor 5X 0.5NAWD 15 mm |
| Z-Drive | Minimum Step Size: 0.1 μm |
| XY Stage (Optional) | FN1 XY Rectangular Stage (Manual); XY Physiology Stage (Manual or Motorized) |
| Excitation | |
| Beam Conditioner (Optional) | Variable Beam Expander (1X - 4X); Motorized Beam Attenuation (λ/2 Wave Plate and Polarizer) |
| Dispersion Pre-Compensation | -6300 fs2 |
| Wavelength Range | 680 - 1400 nm |
| Objective Pupil Diameter | 20 mm (Max) |
| Field of View |
16 mm Diagonal Square (Max) at the Intermediate Plane 700 µm x 700 µm with Nikon 16X Objective at Sample |
| Scanner |
X: 7.8 kHz Resonant Scanner Y: Galvonometric Scan Mirror |
| Scan Speed | 30 fps @ 512 x 512 Pixels |
| Scan Zoom | 1X to ~8X (Approximate) |
| Scan Resolution |
Up to 2048 x 2048 Bi-Directional Acquisition Up to 4096 x 4096 Uni-Directional Acquisition |
| Scan Mode | Point X-Y Scan |
| Primary Dichroic | 680 -1600 nm Longpass |
| Detection | |
| Non-Descanned (NDD) Detectors | Two Ultra-Sensitive GaAsP PMTs Positioned Directly Behind the Objective |
| Wavelength Range | 300-720 nm |
| Filter Cube | Single, User-Changeable |
部件
| Components | Dimensions | Weight |
|---|---|---|
| Scan Head and FN1 Base | 16.6" (L) x 8.4" (W) x 16.5" (H) / (422 mm x 213 mm x 419 mm) | 49.4 lbs / (22.4 kg) |
| Electronics Unit | 12.0" (L) x 3.5" (W) x 17" (H) / (305 mm x 89 mm x 432 mm) | 15.0 lbs / (6.8 kg) |
| Beam Conditioner | 15.5" (L) x 12.0" (W) x 7.0" (H) / (394 mm x 305 mm x 178 mm) | 38.0 lbs / (17.2 kg) |
| Physiology Stage w/ Posts | 17.7" (L) x 23.9" (W) x 1.5" (H) / (450 mm x 607 mm x 38 mm) | 15.0 lbs / (6.8 kg) |
| Dispersion-Compensation Option | 10.0" (L) x 4.1" (W) x 6.5" (H) / (254 mm x 104 mm x 165 mm) | 12.0 lbs / (5.4 kg) |
原理图
一台典型的多光子装置，包括显微镜的、一个光束调整器（MPM-BCU）、一个色散补偿设备（DCOMP-BCU）和一个激光光源（通用）。
上图显示了在一个PHYS24M生理学平台上的MPM200-4四通道多光子显微镜，该平台带有MPM-BCU光束调节器和COMP6300色散预补偿器件，它们都放置在一个5英尺 x 6英尺的SDA150180 ScienceDesk™工作台上。
深度组织成像
多光子显微是一种能够对生物组织极深位置进行成像的技术。MPM200的扩展激发范围使其能够使用波长超过1微米的激光。因此，更多的光子可以到达样品深处的荧光团，这样就改善了最大成像深度。其与直接位于物镜后方的GaAsP光电倍增管组合的全视场非退扫描探测使得探测器可以接受更多重要的光子信号，这些光子被样品散射后仍然可以穿透物镜。
C. Elegens线虫中多巴胺受体的GFP荧光多光子图像。Olympus 20X 1.0W。样品由多伦多大学的William Ryu提供。
活体细胞成像
多光子显微技术非常适合用于样品需要长时间成像的活体细胞研究。其高速扫描特性减少了在活体细胞成像过程中的光漂白效应，这对于细胞成像是很有利的。Thorlabs公司的多光子系统通过一个扫描振镜对实现高速扫描。该系统还采用近红外双光子激发效应，促进了样品的深度渗透，将光漂白效应最小化，与单光子激发技术相比降低了光学毒性。多光子显微技术已经成功用于追踪GFP标记的细胞和细胞结构，如C.Elegens线虫中的G蛋白受体（请参看右图）。
实时活体肾血流动的灌注检测。两个通道使用一个Olympus 20X 1.0 NA物镜以30帧/秒（512 x 512分辨率）同时进行图像采集（ThorlabsN20X-PFH）。血液是与葡萄糖（血浆，绿色）和1微米荧光微球的混合物一起灌注的。在血管中我们追踪两个独立的微球（A和B）。后续帧之间的高瞬时分辨率保证了各微球更精确的速度测量。在绿色的血浆之中我们还可以观察到一些暗色物体，这些暗色物体是红细胞，这样就为血液流动分析提供了额外的依据。这些图像是在关于肾脏研究应用显微技术的IUPUI奥布莱恩中心的研讨会期间获得的。这里向制备样品的Simon Rhodes博士致谢。
鸡肌腱胶原纤维束附近结缔组织界面上的二次谐波图像。比例尺 = 100微米。.
用二次谐波进行无标记成像
通过双光子和三光子激发内源性荧光团、亚细胞的荧光可以不用外加荧光染料就可以进行观察。例如，NAD（P）H、维生素A或核黄素的双光子激发荧光都可以作为功能性生化信息或用作结构标记。二次谐波需要缺乏反演对称性的高度有序结构才能产生。满足该条件的最常见生物组织成分是胶原蛋白，它可以提供细胞外基质上的信息。三次谐波可以在边界界面上进行观察，它对于观察脂质体是非常有效的。
活体成像
多光子显微技术可以实现深度组织成像。上图为表达td-Tomato的小鼠视觉皮层神经元的600微米深度的Z轴堆叠图像结果。神经元的长度通过追迹穿透细胞体的树突而得到。该图像由Tobias Rose博士提供，他来自德国马丁斯瑞德的马普神经生物研究所。
多光子显微理论
当两个或更多光子同时到达荧光团并且其能量总和满足跃迁能级时就会产生多光子激发效应。当荧光团回到基态并经过少量无辐射损耗后，它就会发出一个新的光子。 二次和三次谐波（分别为SHG和THG）则在入射光子同时湮灭并且产生一个能量等于之前光子总和的新光子时才会出现。
MPM200的光路
MPM200是针对680 -1400纳米波段的近红外工作波长而特殊设计的。这些系统在该波段内被优化后，非常适合于各种激光激发光源配合使用。激发光（红色）通过一个光束潜望镜被导入扫描系统之中。用一个扫描振镜对可以实现高速的XY扫描。扫描光束会穿过一个专用扫描透镜和透镜套筒。样品上发出的信号（绿色）通过物镜收集回来并导入非退扫描的光电倍增管探测器模块之中。光电倍增管直接位于物镜之后，这样可以将显微镜主体内的光损耗最小化。其全视场设计使得光在离开样品并被散射后仍能由物镜进行收集，最总到达光电倍增管。在二次分色镜之前有一个近红外封闭式滤光器，能够防止散射的激发激光照射在光电倍增管上。
荧光滤光片立方包含二次分色镜和两个分别位于两个光电倍增管前的发射滤光片。整个光学系统与物镜一起移动，这样能够保证系统后光阑始终保持在最优化的位置。
MPM200横截面图
MPM-200的光路与FN1显微镜的宽场光路是分开的。这样可以对多光子扫描和探测光学元件进行特殊设计，使其最有效地进行工作。通过原封不动地保持FN1的现有光路，显微镜的传统亮场和epi荧光功能将不会受到影响，这还能进一步提高MPM-200系列多光子成像系统的实验灵活性。
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