Elispot在COVID-19新冠疫苗研发的应用

研究显示：代谢紊乱与严重COVID-19的风险增加有关。

COVID-19患者血清中葡萄糖含量的增加与患有和未患有糖尿病的个体预后不良相关（Shen 等人，2020 年）。在细胞水平上，SARS-CoV-2 诱导宿主细胞代谢向受感染细胞中的糖酵解转变，以及针对己糖激酶（糖酵解中的限速酶）的糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖 (2DG))，干扰结肠腺癌细胞 (Caco-2) 细胞和单核细胞中的 SARS-CoV-2 感染（Bojkova 等人，2020 年；Codo 等人，2020 年）。因此，拮抗病毒引起的宿主细胞代谢变化，尤其是糖酵解的药物是COVID-19治疗的候选药物。

此次试验采用的是Elispot技术（酶联免疫斑点检测法），并通过Bioreader®-7000-FzI (Bio-Sys) 对尖峰阳性区域进行定量。

ELISPOT之于疫苗开发

在新冠状病毒肆虐的当下，国内外针对新冠状病毒的疫苗研发正争分夺秒的进行，在疫苗效果评价中，有很多权威期刊文章中指出使用ELISPOT技术检测疫苗的细胞免疫功能是重要的技术手段并已得到广泛使用。
中国药品生物制品检定所在 2003年发布的《预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指标原则》中明确指明：“使用ELISPOT方法检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能，作为检测和评价疫苗的细胞免疫的有效方法”。
此外，世界卫生组织在艾滋病(HIV)疫苗的研究中，也推荐使用ELISPOT检测淋巴细胞分泌γ干扰素功能（WHO-UNAIDS-sponsored training workshop 2003）。

ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）全名为酶联免疫斑点检测，是利用预先包被好抗原或抗体的微量板从单细胞水平检测特异性抗体分泌细胞或特异性细胞因子(cytokine,CK)分泌细胞的免疫学检测技术。1983年，Sedgwick和 Czerkinsky 等根据酶联免疫吸附试验(ELISA)的基本原理结合细胞培养技术，建立并首先报道了这种新技术，用于检测特异性抗体分泌细胞。1988 年该方法被首次用于检测 IFN-γ分泌细胞。
简单来说，就是用在PVDF 膜为底的孔板上包被好的抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其呈现出来。

ELISPOT技术的基本步骤为:

(1) 用抗待检细胞因子的高亲和力的单克隆抗体包被96孔板,然后用1%牛血清蛋白37℃封闭2 h, 阻止非特异性蛋白的吸附。

(2) 将细胞和刺激剂加到孔中孵育一段时间, 此时活化细胞分泌细胞因子。

(3) 洗去多余的细胞。

(4) 加入生物素标记的检测抗体。

(5) 加入酶标记的链亲和素, 加入底物溶液显色检测抗体细胞因子复合物。

数据检测和分析

通过显色反应，在细胞分泌可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可使用BIO-SYS Bioreader对斑点进行计数，进行高通量筛选，检测效率远远高于其它方法。

关于BIO-SYS\Bioreader

由德国BIO-SYS有限公司研制，拥有专利的双远心照明系统，通过使用“光度”强度照明和梯度来区分真/假点。

实验结果输出：

参考文献：

Bojkova D, Costa R, Reus P, Bechtel M, Jaboreck MC, Olmer R, Martin U, Ciesek S, Michaelis M, Cinatl J Jr. Targeting the Pentose Phosphate Pathway for SARS-CoV-2 Therapy. Metabolites. 2021 Oct 13;11(10):699. doi: 10.3390/metabo11100699. PMID: 34677415; PMCID: PMC8540749.