本研究中,SCIEX合作中国食品药品检定研究院重组室,应用微升流速液相色谱串联质谱技术(Microflow LC-MS/MS)对低浓度的AAV2衣壳蛋白(8×1011 GC/mL)进行表征分析,发表在期刊《Applied Biochemistry and Biotechnology》上。通过数据依赖型采集(Information dependent acquisition,IDA)技术进行肽图分析,实现了对AAV2衣壳蛋白将近100%的序列覆盖度,同时获得超过30个翻译后修饰位点鉴定和相对定量信息。通过碰撞诱导解离(CID)技术,获得高质量二级质谱数据实现氨基酸序列完整匹配,以及应用电子活化解离EAD技术实现氨基酸同分异构体区分。微升流速液相色谱(Microflow LC)系统联合ZenoTOF® 7600 系统在实现高通量、稳定分析的同时,兼具良好灵敏度,为大批量、低浓度生物制品样本表征分析提供技术支撑。
ZenoTOF® 7600 系统,Zeno™ trap,将占空比提高到大于90%,减少离子损失,实现更高的MS/MS灵敏度。结合具有稳定、高通量,同时兼具良好灵敏度的微升流速液相色谱系统对低样本量的AAV2样本进行分离,在提升分析灵敏度的同时,获得高质量的二级谱图。通过数据库的匹配分析,AAV2衣壳蛋白序列覆盖度将近100%(图1)。其中通过二级质谱数据匹配的序列达95%,通过一级质谱数据匹配的序列为5%。
图1. AAV2衣壳蛋白序列覆盖度图谱。
Biologics Explorer™ 软件通过预建立的分析流程,在数据库匹配分析模块设置翻译后修饰类型,实现翻译后修饰位点快速、流程化鉴定和定量分析。应用Biologics Explorer™ 软件分析,在AAV2衣壳蛋白中共鉴定到32个修饰位点(表1),修饰类型包括脱酰胺、氧化、乙酰化修饰。其中相对丰度 >1%的PTMs有20个。相对丰度 <1%的PTMs有11个,如N317、Q319、Q464的脱酰胺修饰,A2和L315乙酰化修饰。
应用高灵敏度的微升流速液相色谱系统和Zeno™ trap技术,在实现对低丰度翻译后修饰肽段分析的同时,获得肽段高质量的二级质谱图,实现肽段序列完整匹配。图2分别展示了在第464位和第614位的谷酰氨(Q)发生脱酰胺修饰肽段LQFSQAGASDIR(图2A)和DVYLQGPIWAK(图2B)的Native和脱酰胺修饰两种形式的提取离子色谱图。两条肽段脱酰胺修饰形式的相对丰度均很低,其相对丰度分别仅为0.07% (LQFSQAGASDIR) 和0.38% (DVYLQGPIWAK) 。
表1. AAV2衣壳蛋白鉴定到的翻译后修饰列表
图2. 肽段Native和Deamidated形式提取离子流色谱图。
A. 肽段LQFSQAGASDIR;B.肽段BDVYLQGPIWAK
蛋白质脱酰胺化是天冬酰胺残基侧链发生脱酰胺反应形成天冬氨酸(Asp)或异天冬氨酸(isoAsp)。AAV载体的脱酰胺化可影响衣壳蛋白组装和转导效率,以及影响其组织趋向性和衣壳蛋白与免疫系统的互作[6]。碰撞诱导解离(CID)碎裂是常用的质谱碎裂技术,能够提供氨基酸序列确认。然而,其在区分同分异构体,如Asp和isoAsp具有较大挑战。而电子活化解离(EAD)技术可产生特征性的诊断碎片离子,实现氨基酸异构体的区分[7]。肽段YLGPFNGLDK存在三种脱酰胺修饰形式,EAD二级图谱展示(图3B、D),通过诊断离子z5-57确定肽段YLGPFNGLDK在保留时间22.3min和24.8min对应为isoAsp形式。诊断离子z5-44确证保留时间23.1min对应为Asp形式(图3C)。据文献报道,两种isoAsp形式,L-isoAsp形式丰度相对更高[8,9]。
图3. EAD碎裂模式下,肽段YLGPFNGLDK三种脱酰胺修饰形式XIC图谱(A)及通过EAD碎裂产生的诊断离子确定为Asp或isoAsp(B-D)。通过z5-57诊断离子(绿色标注) 确证为isoAsp (B、D),通过z-44诊断离子确证为Asp (C) 。
1
微升流速液相色谱系统具有稳定、高通量,兼具良好灵敏度的特性,应用微升流速液相色谱系统联合ZenoTOF® 7600 系统实现了对低样本量AAV2衣壳蛋白将近100%氨基酸序列覆盖分析。
2
Zeno™ trap 技术显著提高二级质谱灵敏度,结合CID采集技术获得高质量二级质谱数据,实现氨基酸序列高可信度的完整匹配。
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EAD碎裂技术提供翻译后修饰位点准确定位,以及区分氨基酸同分异构体,为生物制品深度、精准表征分析提供技术支撑。
4
Biologics Explorer™ 软件提供便捷、流程化的分析工具,实现包括完整分子量、肽图分析、翻译后修饰位点鉴定及相对定量快速、自动化分析。
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