合规赋能 | VC双三元液相轻松实现药典正相二维VD测定
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史华进 冉良骥
维生素D简介
维生素D(Vitamin D, VD)是维持人体健康必不可少的一类脂溶性维生素,具有促进肠道对钙、镁和磷酸盐的吸收,调节机体免疫功能等多种生物功效。维生素D家族两大重要成员是维生素D3(胆钙化醇)和维生素D2(麦角钙化醇),它们合称为钙化醇。为了预防和治疗维生素D缺乏,市场上有多种维生素D或复方滴剂供消费者选择。
药典0722维生素D测定第四法
2020版《中国药典》四部通则《0722 维生素D测定方法》中采用高效液相色谱法测定维生素D及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量。在2015版基础上,2020版药典新增了第四法。该法采用正相二维液相色谱,供试品无需经过复杂处理即可进样分析,大大节省了样品前处理的时间。第四法一维色谱柱药典委推荐采用以脲基键合硅胶为填充剂(2.1mm × 150mm, 3um),该规格与赛默飞 Acclaim系列的HILIC-10色谱柱一致。其实,早在2010年左右,赛默飞液相团队就已经向相关食品药品检验院所推荐该色谱柱,共同探讨研究采用二维液相色谱技术测定维生素D的方案,并结合赛默飞独有的双三元液相色谱仪器开展相关实验。
图1.双三元二维液相系统连接示意图
赛默飞特色双三元液相
赛默飞双三元液相早在2006年就已在市场推出,一经推出便得到行业内一致好评,并获得当年匹兹堡金奖。其采用独特的双泵设计,每一个泵都可以独立工作,有各自独立的流动相比例阀和流动相进出系统,可以同时单独控制三种不同的流动相来进行复杂的样品分析。柱温箱部分放置的两个切换阀可以通过变色龙软件的控制在相应的时间进行阀切换,实现流动相流路和色谱柱连接的不同组合切换。因此使用双三元液相可以轻松实现2020版《中国药典》维生素D测定第四法。
VC双三元液相色谱条件
Vanquish™ Core(简称VC)双三元液相采用模块化设计,耐压达700bar,可以兼顾常规液相及部分超高效液相工作。结合配套的正相套件,即可实现正相体系的使用。本实验详细条件如表1所示。
表1. 双三元二维液相色谱条件
(点击查看大图)
实验结果
维生素D3校正因子f1对照品溶液和校正因子f2混合对照品溶液及供试品配置步骤参考药典通则0722 维生素D测定法,实验结果如下:
图2.f2混合对照品溶液一维色谱图(上)和二维色谱图(下)(点击查看大图)
表2. f2混合对照品溶液一维色谱结果
(点击查看大图)
由图2及表2可见,采用双三元液相色谱测定维生素D,前维生素D和维生素D的分离度良好,可已达到9.3,满足药典分离度大于5的要求;两个峰的理论塔板数分别为9568及8798,均远大于药典要求的2300。
图3. 某维生素D滴剂供试品一维色谱图(上)和二维色谱图(下)(点击查看大图)
图3显示该维生素D滴剂供试品一维色谱中,前维生素D 受基质干扰,与干扰峰分离度不佳,维生素D的峰形较宽。经过二维色谱后,前维生素D与干扰峰达到分离,两个目标峰的峰形收窄,更利于维生素D的定量。
图4. f2混合对照品溶液连续进样5针叠加图(上图为一维,下图为二维)(点击查看大图)
实验对方法的重复性做了考察,结果显示连续进样5针,一维前维生素D及维生素D的保留时间RSD分别为0.88%及0.42%,峰面积RSD分别为1.42%及0.96%;二维前维生素D及维生素D的保留时间RSD分别为0.88%及0.42%,峰面积RSD分别为1.21%及0.80%,充分体现了双三元液相两泵的优良性能及整个液相系统的稳定性。
小结
随着2020版药典四部通则0512高效液相色谱法中引入了多维液相色谱(单中心切割、多中心切割和全二维色谱)的介绍,市场对于二维色谱的认知及了解逐渐广泛,也涌现出越来越多二维液相方法,赛默飞特色的双三元液相完全满足各行各业用户二维液相色谱的需求。除二维液相色谱应用外,赛默飞双三元液相色谱仪同样被广泛应用于液质联用在线除盐,Online-SPE(在线固相萃取),串联及并联液相以及特色电雾式检测器CAD反梯度补偿等高级应用,为广大企业用户降本增效。
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