用于单克隆抗体完整结构或亚基精确质量数测定的一体化工作流程

2018/08/27   下载量： 0 次

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单克隆抗体 (mAb) 型药物代表了发展迅速的一类生物药物，对这类药物需要进行深入表征，以便获得临床试验和后续上市的批准。鉴于单克隆抗体具有分子量大及存在翻译后修饰（糖基化）的特征，精确质量数测定是单克隆抗体分析表征中最具挑战性的步骤。这些特性也使得修饰位置的测定更加复杂。 为了应对抗体质量数测定相关的挑战，人们使用了大量补充方法。可以用 PNGase F 处理抗体去除 N-糖链，后用 IdeS 等蛋白酶酶解获得抗体片段，也可还原单克隆抗体，以生成轻链和重链，随后进行质量数测定。这些技术可以各种组合加以应用。样品前处理可能费时费力，而且重现性不佳。本应用简报展示了如何使用 Agilent AssayMAP Bravo 的自动化功能简化这些方法，减少引入人为误差的可能性，提高重现性，并实现更长的无人值守时间。

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前言

单克隆抗体 (mAb) 型药物代表了发展迅速的一类生物药物，对这类药物需要进行深入表征，以便获得临床试验和后续上市的批准。鉴于单克隆抗体具有分子量大及存在翻译后修饰（糖基化）的特征，精确质量数测定是单克隆抗体分析表征中最具挑战性的步骤。这些特性也使得修饰位置的测定更加复杂。

为了应对抗体质量数测定相关的挑战，人们使用了大量补充方法。可以用 PNGase F 处理抗体去除 N-糖链，后用 IdeS 等蛋白酶酶解获得抗体片段，也可还原单克隆抗体，以生成轻链和重链，随后进行质量数测定。这些技术可以各种组合加以应用。样品前处理可能费时费力，而且重现性不佳。本应用简报展示了如何使用 Agilent AssayMAP Bravo 的自动化功能简化这些方法，减少引入人为误差的可能性，提高重现性，并实现更长的无人值守时间。

我们使用两种明确表征的抗体，展示了安捷伦如何提供从原始样品到样品前处理、数据采集和数据分析的完整质量数分析全面解决方案。采用结合生物素化 HER2 ECD（曲妥单抗）或生物素化蛋白质 L (NIST mAb) 的 AssayMAP 链霉亲和素 (SA-W) 小柱，通过 AssayMAP Bravo 对细胞培养上清液进行亲和纯化，得到特异性作用于 HER2 胞外区 (ECD) 的单克隆抗体赫赛汀（曲妥单抗）和 NIST 单克隆抗体标准物质 8671。蛋白质 L 是一种抗体 κ 轻链的亲和试剂。之后，分别使亲和纯化后的赫赛汀和 NIST mAb 保留完整、用 PNGase F 去糖基化或用 IdeS 酶解处理，同时使用柱上反应应用将其固定在 AssayMAP 小柱上。将 PNGase F 和 IdeS 反应生成的可溶性产物（分别为糖链和 Fc/2 重链片段）收集在一个孔板中。将一半固定的完整 mAb、去糖基化 mAb 和F(ab')2 片段从小柱中洗脱到含还原缓冲液的孔中，并将另一半样品洗脱到非还原缓冲液中。所有这些步骤均在 AssayMAP Bravo 上自动进行。为了获得高质量数准确度的数据，这些步骤获得的蛋白质数据均使用 UHPLC与 Q-TOF 质谱的联用系统进行分析。

结论

Agilent AssayMAP Bravo 平台是单克隆抗体表征一体化流程（包括全面的完整 mAb 质量数测量）的关键要素。它能够自动进行样品前处理，可减少人为误差，确保重现性，并允许分析人员离开执行其他任务。目前的研究采用 AssayMAP Bravo，需要 5.5 小时的总时间完成四个小柱的样品前处理。而同样数量的样品采用手动前处理需要花费至少 1 天的时间。如果需要对全部 12 根小柱进行样品前处理（整个板），AssayMAP Bravo 所需的处理时间仍保持在 5–6 小时左右。然而，对整个板进行手动样品前处理，则需要超过 1 天的不间断工作时间。AssayMAP Bravo 提供了一个简便易用的平台，可以实现整个工作流程的自动化，并缩短获得结果的时间。AssayMAP Bravo 经专门设计，能够使用微量色谱柱进行蛋白质和多肽样品的前处理，具有简单可靠的自动化流程和基于应用的用户界面。安捷伦将 AssayMAP Bravo 上的自动亲和纯化和酶解与超高效液相色谱、Agilent AdvanceBio Q-TOF 和简单易用的 Agilent MassHunter BioConfirm 软件集成，为抗体表征提供完整的解决方案。

这一工作流程功能多样，能够实现完整抗体和亚基蛋白质的质量数分析。为了满足综合表征研究的需要，这一流程还能灵活执行柱上去糖基化，用 IdeS 蛋白酶进行蛋白水解，或还原释放亚基，甚至能够将三个步骤结合。ECD 和蛋白质 L 均可从 CHO 细胞培养上清液中纯化出高纯度 mAb。

这种一体化方法还可进行高通量分析，用于抗体前处理的批次间比较。出色的色谱分离度能够快速有效地分离完整抗体及其轻链和重链亚基，还包括不同的二硫化形式。Agilent AdvanceBio Q-TOF 可生成高分辨率谱图，以实现高质量数准确度的蛋白质质量数分析。MassHunter BioConfirm 数据分析软件支持完整的蛋白质分析工作流程，包括自动化数据提取、解卷积和序列匹配。


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