方案摘要
方案下载应用领域 | 生物产业 |
检测样本 | 生物农业 |
检测项目 | |
参考标准 | 企业 |
植物DNA的制备与动物DNA制备原理大致相同,为获得高相对分子质量DNA,应取幼嫩组织或组织培养物为材料,常以液氮冷冻下研磨的方法破组织和细胞。 由于植物材料DNase水平低,蛋白含量较少,其操作要求是要克服植物次生代谢物如多酚、类黄酮和植物多糖与DNA共存对制备的影响。
一、实验原理
植物DNA的制备与动物DNA制备原理大致相同,为获得高相对分子质量DNA,应取幼嫩组织或组织培养物为材料,常以液氮冷冻下研磨的方法破组织和细胞。
由于植物材料DNase水平低,蛋白含量较少,其操作要求是要克服植物次生代谢物如多酚、类黄酮和植物多糖与DNA共存对制备的影响。
二、实验用品
(一)器材
(1)冰冻高速离心机。
(2)液氮罐。
(3)台式离心机。
(4)电热恒温水浴锅。
(5)电热恒温培养箱。
(6)电冰箱,离心管和tip。
(二)试剂
(1)5mol/L Nacl:称取NaCL 146.10g用蒸馏水定容至500ml。
(2)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)缓冲液。
A.2mol/L Tris.HCL缓冲液(pH8.0):24.2g Tris溶于80ml重蒸水中,用浓盐酸调节pH至8.0,用重蒸水定容至100ml。
B.0.5mol/L EDTA缓冲液(PH8.0):取186.12g EDTA.Na2用重蒸水800ml溶解,然后用NaOH调节pH至8.0,加重蒸水至1000ml。
(3)巯基乙醇。
(4)PVP(聚乙稀吡咯烷酮)。
(5)石英砂。
(6)氯仿:异戊醇(24:1),现用现配。
(7)异丙醇。
(8)75%乙醇。
(9)TE缓冲液:取5ml 2mol/L Tris-HCL和2ml0.5mol/L EDT.Na2。用重蒸水定容至1000ml。
(10)RNase A:取100mg RNase溶于10ml含有10mmol/L Tris(pH7.5)-15mmol/L Nacl 的溶液中,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20℃。
(三)材料
水稻幼苗或蚕豆幼苗和白菜嫩叶等。
二、实验程序
(一)操作方法
1.操作步聚
(1)在50ml离心管中加入10ml CTAB缓冲液。
(2)取1~2g新鲜叶片(去主脉)于研钵中,加入0.1gPVP或石英砂,在液氮中迅速研磨成粉末后,把粉末转入带CTAB缓冲液的离心管中,边加边搅拌使之混合均匀。
(3)于65℃水浴保温0.5~1h。
(4)冷却至室温后,加入等体积10mlTrichloromethane异戊醇溶液,颠倒混匀10min。
(5)10000 r/min离心10min,去沉淀,将上清液转入另一离心管中。
(6)在上清液中加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的异丙醇 10ml或2倍体积乙醇,轻缓颠倒混合均匀,于-20℃放置30min。
(7)10000 r/min 4℃离心10min,去上清液。
(8)用2ml75%乙醇洗涤2次去除盐(可放置-20℃冰箱过液)。
(9)倒去75%乙醇,37℃干燥20分钟,再溶于600µL TE缓冲液中,转移至1.5ml EP管。
(10)加入3µL RNase A ,37℃保温30min。
(11)用等体积Trichloromethane异戊醇溶液抽提1~3次。
(12)10000r/min,4℃离心10min,吸取上清。
(13)上清液加入1/10体积4mol/L NaCL溶液后,加入2倍体积无水乙醇,放置20min后,10000r/min,离心5min沉淀DNA。
(14)沉淀用75%乙醇乙洗涤2~3次,37℃保温箱中干燥后溶于适量的TE缓冲液中备用。
2得率的计算
由于1OD260的DNA浓度为50µg/ml,因此DNA得率可按下公式计算:
1g新鲜组织的DNA含量=OD260×50×溶解体积/组织鲜重(µg DNA/g)。
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