【解决方案】水产品中27种性激素的检测

迪马科技

2024/09/30 17:10

水产品中27种性激素的检测SPE-HPLC法
参考《GB 31656.14-2022 食品安全国家标准水产品中27种性激素残留量的测定液相色谱串联质谱法》

激素类药物是人和动物疾病诊疗的常用药物，但不合理的使用会给人和动物健康造成危害。为此，农业部相继发布了《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》(农业部公告第176号)、《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质名单》(农业部公告第1519号)、《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》(农业农村部公告第250号)等公告，禁止性激素等多种激素类药物用于食品动物。

GB 31656.14-2022《食品安全国家标准水产品中27种性激素残留量的测定液相色谱串联质谱法》由中华人民共和国农业农村部、中华人民共和国国家卫生健康委员会和国家市场监管总局于2022年9月20日通过第594号公告发布，自2023年2月1日起实施，并在其第一号修改单中将附录A表A.1中17-α-羟基孕酮的英文名称“17A-acetoxyprogesterone”、分子式“C₂₃H₃₂O₄”、CAS号“302-23-8”，修改为英文名称“17α-Hydroxyprogesterone”、分子式“C₂₁H₃₀O₃” 、CAS号“68-96-2”。该标准检测范围包含了己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、雌酮、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、17-α羟基孕酮、21-α羟基孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、左炔诺孕酮、甲羟孕酮、诺龙、苯丙酸诺龙、睾酮、勃地酮、孕酮、群勃龙、甲基睾酮、雄烯二酮、美雄酮、炔诺酮、康力龙、丙酸睾酮共27种性激素。

迪马科技参考GB 31656.14-2022《食品安全国家标准水产品中27种性激素残留量的测定液相色谱串联质谱法》及其第一号修改单重现了此方法，使用HPLC-MS/MS法，乙酸乙酯和甲基叔丁基醚提取，ProElut^®C18-U和ProElut^®Silica SPE小柱净化提取液，Spursil^® C18-EP 5μm色谱柱分离，内标法定量，测试了草鱼、海虾、海螃蟹样品的可食部分，添加回收率在60%-120%，符合标准要求。

适用范围

本方案适用草鱼、海虾、海螃蟹可食部分己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚、雌酮、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、17-α羟基孕酮、21-α羟基孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、左炔诺孕酮、甲羟孕酮、诺龙、苯丙酸诺龙、睾酮、勃地酮、孕酮、群勃龙、甲基睾酮、雄烯二酮、美雄酮、炔诺酮、康力龙、丙酸睾酮的检测。

标准品配制

(1)27种性激素混合标准储备液：迪马标准品部提供(Cat.#: 48337)；

(2)混合标准中间液Ⅰ：准确吸取0.1mL混合标准储备液，用甲醇定容至10mL，配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、17-α羟基孕酮、21-α羟基孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、甲羟孕酮、诺龙、苯丙酸诺龙、睾酮、勃地酮、孕酮、群勃龙、甲基睾酮、雄烯二酮、美雄酮、丙酸睾酮终浓度1μg/mL，己烷雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、康力龙终浓度2μg/mL，雌三醇、炔雌醇终浓度4μg/mL的混合标准溶液；

(3)混合标准中间液Ⅱ：准确吸取0.2mL混合标准储备液，用甲醇定容至1mL，配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、17-α羟基孕酮、21-α羟基孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、甲羟孕酮、诺龙、苯丙酸诺龙、睾酮、勃地酮、孕酮、群勃龙、甲基睾酮、雄烯二酮、美雄酮、丙酸睾酮终浓度0.2μg/mL，己烷雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、康力龙终浓度0.4μg/mL，雌三醇、炔雌醇终浓度0.8μg/mL的混合标准溶液；

(4)混合内标工作液：分別准确吸取内标储备液，用甲醇稀释至雌二醇-¹³C₂浓度2μg/mL，己烯雌酚-D₈、雌酮-D₂、甲基睾酮-D₃、孕酮-D₉、甲羥孕酮-D₃、左炔諾孕酮-D₆浓度1μg/mL。

提取

称取试样5g，于50mL离心管中，准确加入30μL混合内标工作液和乙酸-乙酸钠缓冲液10mL，涡旋30s，加乙酸乙酯-甲基叔丁基醚溶液10mL，涡旋1min，超声10min，涡旋混合1min，于8000r/min离心8min，取上层有机相于100mL梨形瓶；残渣用乙酸乙酯10mL重复提取1次，有机相合并至梨形瓶中，于35℃水浴旋转蒸发至干，氮吹旋蒸瓶中剩余油脂，将乙酸乙酯吹除干净，加入正己烷7mL溶解残留物，待净化。

乙酸-乙酸钠缓冲溶液：取13.0g无水乙酸钠，冰乙酸2.6mL，用水定容到500mL。

乙酸乙酯-甲基叔丁基醚溶液：取乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等体积混合。

净化

草鱼样品：

ProElut^® C18-U 500mg/3mL (Cat.#: 63504)

(1)活化：依次用5mL甲醇、5mL正己烷活化；

(2)上样：加入待净化液，流速控制不超过1秒/滴；

(3)淋洗：加入10mL正己烷；

(4)洗脱：加入10mL甲醇，收集洗脱液；于40℃水浴旋转蒸发至干；

(5)重新溶解：准确加入甲醇0.85mL，涡旋混合1min，再准确加入水0.15mL，混合30s，8000r/min离心6min，上清液用0.22μm尼龙滤膜过滤，待测。

海虾、海螃蟹样品：

ProElut^®C18-U/Silica/500mg/500mg/6mL

(1)活化：依次用5mL甲醇、5mL正己烷活化；

(2)上样：加入待净化液，流速控制不超过1秒/滴；

(3)淋洗：加入10mL正己烷；

(4)洗脱：加入10mL甲醇，收集洗脱液；于40℃水浴旋转蒸发至干；

(5)重新溶解：准确加入甲醇0.85mL，涡旋混合1min，再准确加入水0.15mL，混合30s，8000r/min离心6min，上清液用0.22μm尼龙滤膜过滤，待测。

注：同方法制备基质匹配标准溶液

分析条件

(1)HPLC条件

色谱柱：Spursil^® C18-EP, 150x4.6mm, 5μm (Cat.#: 82101)

流速：0.4mL/min

进样量：10μL

柱温：30℃

流动相：A: 0.02%氨水 B:甲醇

梯度设置：

(2)质谱条件

电离模式：ESI

扫描方式：正/负离子扫描

检测方式：多反应监测

电喷雾电压：5500/-4500V

雾化气压力：50psi

辅助气压力：50psi

气帘气压力：20psi

离子源温度：500℃

定性离子对、定量离子对、碰撞气能量及去簇电压见下表

样品添加回收结果

(1)草鱼

(2)海虾

(3)海螃蟹

目标化合物的XIC图

标准品己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、17-α羟基孕酮、21-α羟基孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、甲羟孕酮、诺龙、苯丙酸诺龙、睾酮、勃地酮、孕酮、群勃龙、甲基睾酮、雄烯二酮、美雄酮、丙酸睾酮浓度5ng/mL，己烷雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、康力龙浓度10ng/mL，雌三醇、炔雌醇浓度20ng/mL，雌二醇-¹³C₂浓度60ng/mL，己烯雌酚-D₈、雌酮-D₂、甲基睾酮-D₃、孕酮-D₉、甲羟孕酮-D₃、左炔诺孕酮-D₆浓度30ng/mL检测的XIC图

标准品己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、17-α羟基孕酮、21-α羟基孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、甲羟孕酮、诺龙、苯丙酸诺龙、睾酮、勃地酮、孕酮、群勃龙、甲基睾酮、雄烯二酮、美雄酮、丙酸睾酮浓25ng/mL，己烷雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、康力龙浓度50ng/mL，雌三醇、炔雌醇浓度100ng/mL，雌二醇-¹³C₂浓度60ng/mL，己烯雌酚-D₈、雌酮-D₂、甲基睾酮-D₃、孕酮-D₉、甲羟孕酮-D₃、左炔诺孕酮-D₆浓度30ng/mL检测的XIC图

标准品己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、17-α羟基孕酮、21-α羟基孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、甲羟孕酮、诺龙、苯丙酸诺龙、睾酮、勃地酮、孕酮、群勃龙、甲基睾酮、雄烯二酮、美雄酮、丙酸睾酮浓度100ng/mL，己烷雌酚、雌二醇、苯甲酸雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、康力龙浓度200ng/mL，雌三醇、炔雌醇浓度400ng/mL，雌二醇-¹³C₂浓度60ng/mL，己烯雌酚-D₈、雌酮-D₂、甲基睾酮-D₃、孕酮-D₉、甲羟孕酮-D₃、左炔诺孕酮-D₆浓度30ng/mL检测的XIC图

目标化合物的定量离子色谱图

更多谱图详见左下方“阅读原文”。

小结

(1)草鱼、海虾、海螃蟹样品，27种性激素添加回收率60%-120%，符合标准要求；

(2)苯甲酸雌二醇和孕酮不同于标准，选择了加NH₄峰，响应强度更高，便于定量；

(3)海虾和海螃蟹样品净化小柱多加一层Silica吸附填料，可以避免这类比较脏样品上样时过载导致的己二烯雌酚和己烷雌酚流失、回收率异常的现象，提高回收结果。

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