色谱双峰指的是同一种物质,在色谱图中表现出双峰,让我们误以为是两种物质。那为什么会出现这种情况,在实验过程中又该怎么避免,今天小编就和大家一起来聊一聊。
在HPLC分析中,在色谱柱正常、样品浓度适宜、分析方法合适、色谱峰在出峰时间较短的情况下,峰形应是一个高斯峰型,对称而尖锐的。然而在实际操作中,如果对样品性质不了解,前处理不恰当或者分析方法不合理时,就会出现峰形不正常的情况,其中双峰现象是液相色谱常见的问题之一。出现色谱双峰的原因一般有以下几种:
色谱柱 如果在分析样品时发现每个色谱峰都是双峰,尤其是分析单一纯物质时,则可以确定是色谱柱出现问题了,一般是柱头受损引起的。如果进样量少,原来色谱峰正常,峰形多为一大峰带一小峰,不一定拖尾时,应考虑是柱头端被堵塞,可以将色谱柱反接(月旭的色谱柱可以反冲),用流动相或酸或其他有机溶剂冲洗,将堵在柱头端的物质冲掉后,再正接测试,通常会有改善。当然也可以不反冲,正冲有时也有效果。 如果双峰强弱相差不大,柱头端填料变脏或柱流失的可能性更大,这时可以把柱头拧开,将筛板取下超声,柱头端刮去被污染的填料,填上新填料后再拧紧,不过这个zui好是由专业人员操作且不能经常做,否则用不了几次,色谱柱就会应柱效降低而报废。如果上述操作仍不能解决问题,则可能是柱塌陷造成的,需要更换色谱柱。 溶剂 目前HPLC分析多为反相色谱,流动相多为甲醇、乙腈、水,加入各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解,zui佳的溶解方法是用流动相溶解。在实际分析中,有时候为了样品的溶解性或稳定性加入了一定的缓冲液,缓冲液的酸碱性可能会导致样品转化,从而产生双峰现象。此时需要更换缓冲液,调整溶剂pH值,或者用流动相配置样品。 此外,样品要现配现用,避免因样品溶解液的有机相比例、pH值发生变化而导致的溶剂效应。 进样量 当用溶剂极性强度大的试剂溶解样品,如甲醇、乙腈、乙醇等,而分析体系以水为主时,如果样品进样量大,比如进20μL,此时目标物会出现双峰,第二峰比di一峰小(每次都不太一样),且拖尾,保留时间会提前(相对进样量少而言),将进样量减少一半以上,峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大,而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的,这种情况下需要减少进样量或者用流动相溶解样品。 另一个原因是,进样量不一定大,但jue对量很大,色谱图上的双峰紧靠在一起,基本上齐高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色谱柱问题)。将样品稀释再进样就可以了,这是由于进样量过大,色谱柱过载造成的。 pH值 体系pH值对色谱双峰的影响出现在各个环节上,尤其在缓冲液流动相平衡过程中其影响更为明显。当连续进样时,受pH的连续变化影响会经常遇到这种双峰的情况。另外,在样品分析时,流动相的pH尽量远离被分析物的等电点,否则也容易引起产生双峰。在用离子对试剂分析时,液相条件没选择好也会引起双峰。 样品特性 有些样品由于其化学结构的特点,存在异构体。有的样品紫外的色谱图上看不到双峰,但在LC-MS下,其质谱的总离子流图(TIC)上较明显,如啶虫脒。 仪器参数设置 参比波长设置错误,例如设置分析波长254nm,参比波长400nm,这个对于大多数化合物可能没影响。但是如果被测化合物,在400nm处也有强的紫外吸收,比254nm更高。这样其出峰时,由于背景的抵扣作用,本来一个峰会变成对称的二个峰,而且如果将二峰之间的峰谷反转180度,恰好是一个完整的峰。这时要将参比波长设置更大,或者取消。 当然,如果仪器存在较大死体积,也可能会导致双峰出现。 在对样品不够了解,分析方法不当,样品处理方法及进样方式不合理情况下,会出现各种意想不到的问题,也很难对色谱峰作出合理的解释,尤其对于新手更是如此,所以,了解每种异常出现的原因,并根据原因采取合理的改进措施,是避免异常峰出现的zui有效的办法。
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