梯度洗脱可用于处理不能以等度洗脱分离的样品,而最常见的使用梯度的因素是多成分保留能力不同,无法在等度洗脱中全洗脱出来,或以等度方式无法达到满意的分离效果。总结下来,以下几种情况,可以采用梯度洗脱:
1、多组分样品的极性范围大,用等度无法全部洗脱的样品;
2、大分子样品;
3、改善峰峰型;
4、目标峰出峰后,短时间内提高有机相比例,洗脱强保留干扰杂质;
5、用等度洗脱无法达到分离的情况。
#01
多组分样品的极性范围大,
用等度无法全部洗脱
具有不同保留值范围的多组分,无法使用同一个等度wan全洗脱下来。用同一个等度,会出现要么部分成分无保留没法分离,部分强保留无法洗脱下来,或一针洗脱时间过久的问题,这种情况下,选择梯度洗脱,使流动相洗脱能力从弱到强,从而达到不同保留值范围的多组分在同一个条件下实现分离。
#02
大分子样品
大分子量样品(肽、蛋白质、合成聚合物等)一般采用梯度洗脱分离会更好,尤其是反相条件。这类样品,往往对有机相的量特别敏感,有机相的微小变化就会使样品的保留时间发生很大的变化,导致用等度条件检测时,无法使保留时间控制在一个稳定合适的范围内。
#03
改善峰型
有些成分,在使用等度洗脱时,峰型不佳,不能满足检测需求,这种时候,可以采用梯度洗脱来改善峰型。因此,哪怕是单一成分的含量测定,有时也会用到梯度洗脱进行测定。
示例:4-哌啶甲酸的检测
由对比图可以发现,4-哌啶甲酸成分,在使用等度洗脱时,不对称度3.8,拖尾明显,采用梯度洗脱后,不对称度为1.78,拖尾现象改善明显。
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