在建立一个分析方法时,我们重点关注的就是峰形、分离度和灵敏度。那么,影响峰形、分离度和灵敏度的因素有哪些?如何改善待分析物峰形,增大分离度,提高灵敏度呢?
01
分离模式
了解样品的主要性质,是选择分离模式的关键。针对特定的分析物,选择合适的分离模式,是进行有效色谱分离的首要问题。
02
固定相
色谱柱的选择是建立液相色谱方法时必须考虑的问题,选对色谱柱往往可以实现事半功倍的效果。常用的色谱柱主要有C18、C8、苯基柱、氰基柱、氨基柱、离子交换柱等。
C18柱是方法筛选时最常用的色谱柱,对于疏水性较强(LogD>0)的待分析物往往有很好的保留。C8和C4柱等是保留能力稍弱于C18的经典反相色谱柱。另外,根据待分析物分子量、流动相中水相比例、pH等的差异,可以选择不同类型的色谱柱。
苯基柱和五氟苯基柱存在中等强度的疏水相互作用和强π-π相互作用,五氟苯基柱还存在强的偶极作用,对于芳香族化合物,特别是苯环上的位置异构体,常规C18无法通过疏水相互作用将其有效分离,苯基柱可以通过它们之间的π-π相互作用差异实现分离。
对于C18上没有保留的化合物,氰基键合相是个很不错的选择。氰基键合相在正相和反相模式中均可以使用。在反相色谱中,氰基的疏水性相对较弱,且由于具有π-电子作用,适用于C18柱保留较弱的样品。在正相色谱中,氰基的极性相对更弱,是保留能力最小的正相吸附剂。
氨基柱可用于正相、反相和弱阴离子交换,在反相条件下特别适合分析糖类物质,在正相条件下可用于分析一些溶于烷烃、烯烃和芳香烃的有机化合物,在低pH缓冲液中能分离带负电荷的分子。
03
流动相
流动相的选择和比例调整是开发方法最重要的环节,很多时候分离度不好、峰形差的问题都可以通过调整流动相来解决。流动相的选一般遵循由强到弱,先粗调再微调的思路。
由强到弱:即首先选择强洗脱条件,以快速得到分离结果,然后再根据出峰情况调整流动相比例。
先粗调再微调:当分离达到一定程度,对流动相的比例、缓冲盐pH等条件的调整就要做的更加精细,以优化得到最佳分离条件。
04
柱温
柱温对保留时间、柱压和峰形都有一定的影响。一般来说,升高柱温,保留时间缩短,柱压降低。但有时也会出现保留时间随柱温升高而延长的情况,特别是用键合极性基团的反相柱分离一些极性化合物的时候。
对于一些拖尾较严重的化合物,适当升高柱温,可以有效改善峰形和柱效。对于大分子的分析,尤其是运行流速较高时,适当升高柱温,可以降低柱压、改善柱效。在手性分离中,一般则是低柱温有利于提高分离度。
柱温对峰面积的影响一般不怎么明显,只有部分离子化合物在不同温度下的电离程度不同,吸收波长和吸收强度会随之发生变化,从而影响峰面积大小。
05
溶剂
一般情况下,溶剂对峰形的影响比较小,但是对于一些峰分叉、拖尾等异常色谱行为,也要考虑到溶剂效应的影响。特别是在溶解样品的溶剂强度大于该样品出峰时流动相强度时,容易出现色谱峰的展宽或者分叉(反相色谱中的溶剂强度顺序为水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷)。
另外,在进样体积较大或溶剂和流动相兼容性差时,也容易导致峰形问题,甚至是保留时间差异。溶剂和流动相的pH差异有时候会引起化合物电离状态的变化,也会引起峰形和保留时间问题。
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