固相萃取主要影响因素
固相萃取是一个目标物在固定相上吸附、解吸附/洗脱的过程,因此影响吸附、解吸附、洗脱的因素都会直接影响萃取的效率,如填料类型、洗脱溶剂的强度、pH、流速等。
填料
填料是固相萃取技术的核心,选择对目标物具有适中吸附性的 SPE柱填料是确保检测准确的前提。当然针对同一种目标物,我们可以选择不同的柱料,但是要注意方法的调整。
洗脱溶剂的强度
固相萃取是固定相-填料与流动相-上样溶剂/洗脱溶剂对目标物的竞争吸附作用,所以在上样时,要选择有机溶剂含量或pH都合适的上样液,以避免目标物在上样时漏掉。而在洗脱时,也必须选择适合的溶剂强度,即有机溶剂的含量或pH,以确保能将吸附在填料上的目标物彻di洗脱下来。
pH
对于离子交换固定相,被分析成分与干扰物质的pKa(等电点)各不相同。通过调节溶剂pH的大小,可以使固定相带电荷,被分析物带相反电荷,而使干扰物质不带申荷:或使固定相带申荷,干扰物质带相反申荷,而使被分析物不带电荷。
流速
上样流速和洗脱流速会影响吸附或解吸附/洗脱的效果,上样和洗脱的流速一般控制在1mL/min以内。对于大量样品痕量富集,如环境水样中有机物的富集,上样流速不超过5mL/min。除了以上的几个因素,一些操作步骤完成的情况,如活化的程度、淋洗步骤的抽干等,也会影响结果的回收率或重现。
固相萃取过程Q&A
1. 为什么SPE小柱操作要强调流速?
答:大多数实验人员都希望实验做的又快又好,在固相萃取实验中,往往偏好用比较快的流速过柱。这里就必须要注意流速太快的弊端。因为SPE小柱的填料装填压实以后,形成柱床,当溶剂流过小柱,速度过快将导致两个问题,一个问题是对于键合相填料,由于流速快而使得其不能充分浸润舒展,因而导致其保留活性降低;其次过快的流速导致小柱可能形成沟渠,使得填料未被充分浸润,降低了吸附填料与样品的接触面积,影响了目标物质的传质过程,因而导致回收率降低。
2. 溶剂环境的pH怎么影响化合物在小柱上的保留?为什么我们要关注化合物的pKa值?在C18小柱中需要考虑这些因素吗?
答:首先我们来说一下,Ka指的是酸度系数,又名酸离解常数,可以理解为酸离解H离子的能力,而pKa=-lgKa,对于酸,在环境pH下存在如下平衡:
左边的A-/HA,实际是指溶剂环境下,离子态和分子态的比例,右边反映了左侧两者的转化关系,取决于(pH-pKa)的数值大小。对于离子交换小柱,保持目标物的离子化而非分子态,是一个关键点,这对于离子交换作用机理的交换柱,将直接关系到其实验成败。而对于硅胶键合C18小柱的萃取,由于硅胶(—SiOH)不能wan全“封端”,在pH大于4.0的情况下,硅胶都会带上负电荷,因而会使得能电离的化合物与硅胶作用,增强了这种附带的次级作用力(主作用力为非极性相互作用力),而使得此类物质在硅胶-C18上的保留增强,若只考虑C18的非极性作用力,必然会导致回收结果不尽如人意。
3. 为什么在农残检测过程中GCB常见于净化模式,而不用于富集模式?
答:SPE的净化模式常被用来吸附杂质,而富集模式常被用来吸附目标物质,GCB是一种石墨化碳黑,它由六个碳原子构成平面六角形,并且层叠而成,对于芳香平面分子,很容易嵌入,而具有较强吸附芳香化合物的选择性,对于其他分析物也有较好的吸附性能,填料的吸附与解吸附的性能将直接影响填料的使用范围,对于GCB而言,其吸附性能较强,但是解吸附的可逆性稍差,需要选择合适强度的溶剂来释放被吸附的物质,因而造成了解析溶剂匹配较为困难,由于其对色素等的优秀吸附性能,因而在农残样品处理中,常用来吸附色素等杂质,而不是选择用来保留目标化合物。
4. 淋洗步骤通常需要抽真空干燥,这个原因是什么?
答:淋洗后通常要抽真空干燥,主要作以下考量:
1)通常由于反相萃取在化合物的前处理中使用的比较多,正如反相色谱在色谱中作为常见的分离方法一样,在反相萃取中的淋洗液常为水相或者含水的缓冲溶液,去除水份,可以便于后续干燥浓缩步骤。
2)有的项目,在淋洗步骤完成后,直接用一定体积的洗脱液,比如1mL的甲醇洗脱,此过程将洗脱与定容集为一步处理,前一步的处理必然对洗脱步骤的定量结果产生影响。
3)便是溶剂互溶问题,当淋洗步骤使用的溶剂极性与洗脱溶剂的极性差异较大时,会产生乳化分层,洗脱阻力大,洗脱液被稀释的风险等,导致洗脱效果的差异,以致于实验结果的失败。
5. 我们在使用硅胶键合填料类型的色谱柱的时候,出于对色谱学的常识,知道了硅胶键合填料一般厂商建议的pH使用范围为2-8,那么对于使用硅胶键合的填料的固相萃取小柱,是否需要严格遵守这样一条规定?
答:首先,我们需要了解到,厂家建议的pH2-8的耐受范围,是为了保证色谱柱的正常使用寿命,当pH值超出酸性范围时,键合相易发生水解而流失;当pH超出碱性范围时,会加速硅胶的溶解。因此会损害色谱柱柱效和保留特性,但是我们知道这个pH耐受值范围外的溶剂对于色谱柱的影响,主要是一个积累性的过程,在溶剂冲刷下,逐渐溶解而导致色谱柱性能改变和不可逆,寿命减短。SPE小柱和色谱柱的一个差异就是,SPE是一次性消耗品,在耐受的溶剂范围外,短暂时间的溶剂冲刷对于小柱的保留特性影响甚微,并不会导致其保留显著差异,因此其使用的pH范围更宽,一般可以在pH值范围1-10使用,而不会导致其结果的差异性。
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