在反相色谱中,流动相的选择原则是:
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非极性/中性化合物分析一般用有机溶剂和水。极性(特别是离子型)化合物分析时,通常需要在水中加入酸/碱或者缓冲盐来调整流动相pH值以获得对称的峰形和合理的保留时间。
向流动相中加入改性剂主要有以下两种方式:
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01 氢离子抑制法
● 对于弱酸(3≤pka≤7)/弱碱(7≤pka≤8)组分,一般通过调节流动相的pH来抑制目标化合物的解离,以达到分离目的。弱酸的反相色谱保留值随流动相pH值的减小而增大,当pH值远小于弱酸的pka值(pH<pka-2)时,弱酸99%以上以分子形式存在,有利于在反相色谱柱上保留。
● 对于弱碱,情况相反(须pH>pka+2)。因此分析弱酸样品时,通常在流动相中加入少量酸性缓冲液,如三氟yi酸等(实例见图1);分析弱碱样品时,则加入少量碱性缓冲液,如三乙胺等。
● 下表列出几种常见缓冲盐的pH值可用范围。一般缓冲盐浓度在5-50mmol/L范围就够用,浓度高的缓冲盐(>50mmol/L)虽然缓冲能力增强,但可能在与高比例有机相混合时析出,对液相色谱输液泵等产生不利影响。
1-草酸;2-酒石酸;3-奎宁酸;4-甲酸;
5-丙酮酸;6-苹果酸;7-抗坏血酸;8-乳酸;
9-乙酸;10-马来酸;11-柠檬酸;12-富马酸;
13-顺乌头酸;14-丙烯酸;15-丙酸;16-柠康酸
02 离子对色谱法
● 对于强酸/碱及其他离子型化合物,需要在水中加入相应的“对/反离子”,使其与待测组分离子结合生成弱极性的离子对化合物(中性缔合物),以增加其在反相色谱柱(如C18、C8)上的保留,从而改善分离效果。
● 离子对试剂一般可分为酸性和碱性两大类:
1)分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐(实例见图2),如己烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠等。
2)分离多羧基、磺酸基等酸性物质常用四丁基季铵盐,如四丁基溴化铵、四丁基氯化铵等。被测组分保留时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值等都有关。
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