黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种被国际癌症研究机构(IARC)列为1类致癌物的物质,被认为是目前最常见的致癌物之一。它主要存在于土壤、动植物、各类坚果(花生、核桃等),此外,在豆类、稻谷、玉米、通心粉、食用油、牛奶、调味品等中也经常发现它的身影。现行标准《食品安全国家标准 食品中真菌毒素含量》(GB 2761-2017)中规定,调味品(酱油、醋、酿造酱)的限量值为5.0μg/kg。睿科集团采用免疫亲和柱净化,分析酱油中的黄曲霉毒素B1。试样经过乙腈提取,提取液经离心、稀释后用含有黄曲霉素B1特异抗体的免疫亲和柱净化。用10mL水淋洗柱子将免疫亲和柱上的杂质除去,以甲醇洗脱免疫亲和柱,经高效液相色谱质谱仪上机分析。
图1 4种黄曲霉毒素的结构式
一、耗材
黄曲霉毒素B1免疫亲和柱3ml-20支/盒,300ng(货号:HC-QHZ-0001)
甲醇(Merck,色谱纯)、乙腈(Merck,色谱纯)、超纯水
二、标准曲线配制
黄曲霉毒素B1母液浓度为2μg/mL(2000ng/mL),稀释成100ng/mL中间工作液,用10%乙腈水初始流动相稀释,配制一条浓度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL的标准工作曲线。
三、样品提取与前处理
样品制备
取50mL离心管,称取5g酱油待测样品
样品中加入乙腈定容至25mL ,涡旋震荡10min,离心机4000rpm离心5min
移取上清液2mL至新的50mL离心管,加入 AFB1 标准品5ng ,混匀
用PBS溶液定容至25mL,混匀,备用
样品净化
免疫亲和柱在室温下,回温半小时,将步骤4中25mL溶液加入免疫亲和柱。注:免疫亲和柱中原PBS溶液不用提前排出
样液全部通过免疫亲和柱后,加入10mL超纯水淋洗
淋洗液全部通过免疫亲和柱后,压入2-3mL气体,排干残留溶液
向免疫亲和柱中加入1mL甲醇洗脱目标物至5mL离心管
洗脱完成后压入2-3mL气体,全部排出洗脱液,涡旋震荡混匀
洗脱液过0.22μm滤膜后直接上机检测
四、液相色谱参考条件
色谱柱:C18(柱长100mm,柱内径:2.1mm;填料粒径1.7μm)
流速:0.300mL/min
流动相:A相:5mmol/L乙酸铵溶液;B相:甲醇:乙腈=1:1
柱温:40℃
进样体积:10μL
梯度洗脱:32%B(0min~0.5min),45%B(3min~4min),100% B(4.2min~4.8min)
32%B(5.0min~7.0min)
图2 标准溶液TIC图(1、2、5、10ng/L)
五、样品测试
标准曲线测定
配制浓度为1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL的标准溶液,按照上述样品制备步骤进行前处理后,经GC/MSMS上机分析,得到黄曲霉毒素B1的工作曲线。
图3 黄曲霉毒素B1标准曲线
酱油加标测试
称取酱油样5g于50mL离心管,添加5ng/mL的黄曲霉毒素B1的标准品,进行上述步骤的前处理净化,样品回收率如下表1所示。
表1酱油加标上机回收率结果·添加水平为5ng/mL
样品基质 | 回收率1·% | 回收率2·% | 平均回收率% n=2 | RSD·% |
酱油 | 101.07% | 94.39% | 97.73% | 4.73% |
六、结果与讨论
本文参考GB5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》,采用免疫亲和柱净化,高效液相色谱质谱检测,建立了酱油样品基质中黄曲霉毒素B1高灵敏度的前处理和分析方法,得到黄曲霉毒素B1的加标回收率在94.39%-101.07%之间,RSD值小于5%,可满足快速、准确的检测需求。
七、自动化解决方案
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