新芝生物丨接触式超声在胞内蛋白及核酸提取过程中的应用

宁波新芝生物科技股份有限公司

2024/09/27 18:37

背景

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），又称内毒素，为革兰氏阴性菌细胞壁外壁的组成成分，可作用于膜受体激活多种细胞（巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞等）信号转导系统，促进促炎细胞因子和其他炎性介质的合成及释放，引发炎症反应。客户采用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症模型，使用超声波细胞粉碎机将蛋白及核酸从炎症细胞中分离出来，从基因、蛋白相对表达水平方面评估羊栖菜多酚（Hizikia fusiformis polyphenols，HFPs）的抗炎活性，为其在新型抑炎制剂的开发利用提供理论依据。

材料与方法

1.1

羊栖菜多酚的制备

取干燥羊栖菜粉末，加入体积分数60%乙醇溶液，使用 SCIENTZ-IID 超声辅助浸提（料液比1∶20（m/V）、50 ℃、60min），抽滤后真空减压蒸馏去除乙醇，获羊栖菜粗多酚溶液，依次采用等体积石油醚、乙酸乙酯分级萃取，真空减压蒸馏后冻干（使用 SCIENTZ-12N 过夜冻干），获得HFPs粉末。测得HFPs粉末总酚含量为23.67±0.24 mg/g。利用无菌水配制成多酚母液，再以细胞培养液稀释至不同浓度，用于后续实验。

1.2

炎症细胞培养

使用完全培养基（含10%（体积分数，下同）胎牛血清和1%青链霉素双抗DMEM培养基）培养RAW264.7细胞，37 ℃、5% CO2培养，细胞融合度约80%时进行传代。然后分成3组进行培养：

①阴性对照组，仅加入含10%胎牛血清的DMEM培养基；

②LPS阳性对照组，加入含LPS（1μg/mL）和10%胎牛血清的DMEM培养基刺激24 h；

③HFPs+LPS组，经含不同质量浓度（10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350μg/mL）HFPs和10%胎牛血清的DMEM培养基培养24 h后，以含LPS（1μg/mL）和10%胎牛血清的DMEM培养基刺激24h。

1.3

RAW264.7细胞炎症相关基因相对表达量的测定

1.2中培养的三组细胞培养结束后弃去培养液，用0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗细胞2次，每孔加入500μL TRIzol试剂，使用 SCIENTZ-IID 加速破碎细胞协助提取总RNA，超声参数为：100W，1s开1 s关，共1min，并将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，采用SYBR Green嵌合荧光法与引物进行实时荧光定量PCR。测定目的基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS）和内参基因次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，hprt1）Ct值，采用2－ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.4

MAPKs、NF-κB信号通路关键蛋白相对表达量测定

1.2中培养的三组细胞培养结束后弃去培养液，用0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗细胞2次，加入200μL RIPA细胞裂解液，使用 SCIENTZ-IID 加速破碎细胞协助提取蛋白质，超声参数为：100W，1s 开1s关，共1min，离心（12000r/min、4 ℃）10min取上清液。采用BCA蛋白质量浓度测定试剂盒测定各组蛋白浓度，用蛋白上样缓冲液调整蛋白质量浓度为2mg/mL，95 ℃加热10min使蛋白变性然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；湿转到聚偏二氟乙烯膜；5%（质量分数）脱脂奶粉（TBST溶液配制）封闭1h；一抗4 ℃孵育12h；二抗室温孵育2h；加入ECL试剂进行显色反应，测定蛋白条带灰度值。以β-actin为内参，目的蛋白包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和p-JNK，分别以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表示相应蛋白磷酸化水平。

结果与分析

RAW264.7细胞炎症相关基因相对表达量的测定结果

采用实时荧光定量PCR测定HFPs对LPS诱导的巨噬细胞中重要促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α基因相对表达量，以及炎症相关酶COX-2基因相对表达量的影响。如图1所示，LPS刺激不同时间后，所有炎症介质的mRNA表达水平均显著提高（P＜0.05）。HFPs对促炎细胞因子的抑制作用与其剂量、LPS诱导时间及细胞因子种类相关。与LPS组相比，静息状态细胞经HFPs处理再经LPS诱导12、24h后，IL-1β和IL-6的基因相对表达量显著下降；HFPs显著抑制LPS诱导3h后TNF-α基因的相对表达，而在LPS诱导6～24h的抑制作用总体不明显。在LPS诱导24h，较低剂量HFPs（30、60μg/mL）预处理对COX-2基因表达具有显著抑制作用，但提高剂量后该抑制效果消失，甚至出现反向促进作用，120μg/mL HFPs预处理促使COX-2相对表达量较LPS组显著上升（P＜0.05）。

MAPKs、NF-κB信号通路关键蛋白相对表达量测定

总结

客户采用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症模型，使用超声波细胞粉碎机将蛋白及核酸从炎症细胞中分离出来，从基因、蛋白相对表达水平方面评估羊栖菜多酚（Hizikia fusiformis polyphenols，HFPs）的抗炎活性，为其在新型抑炎制剂的开发利用提供理论依据。超声波细胞粉碎机在整个实验中起到作用如下：

辅助提取羊栖菜中多酚组分，加速多酚组分释放，缩短了提取进程，后续通过冻干步骤即可获得羊栖菜多酚粉末，溶解后备用；

搭配TRIzol试剂对细胞中总RNA进行提取，试剂中含有苯酚，可加速细胞破碎和核酸释放，还加入核酸酶抑制物质防止RNA降解，PCR结果表明提取的RNA浓度与纯度较好，可用于相关基因表达情况的分析；

搭配RIPA裂解液对细胞中的蛋白质进行提取，大幅减少原本冰上裂解所需时间（30 min），试剂中含有的蛋白酶抑制剂可防止蛋白降解，还含有磷酸酶抑制剂，防止蛋白提取后的再修饰，更好测定蛋白磷酸化状态。

—————

关于新芝生物

新芝生物（430685）是国内知名的生命科学仪器设备提供商，围绕国家生物制造重大战略，为用户提供从研发到产业化一站式合成生物工艺解决方案。公司拥有多种产品系列，100余款各类仪器，15,000余家终端实验室客户，超过100,000台各类仪器的市场保有量。覆盖全国的销售和服务网络可及时满足客户的需求。

免责声明：本宣传文案部分文字、图片来源于知网文献、知乎、百度等公开渠道；新芝生物尊重原创，也注重分享；本公众号的部分文字版权均归原作者及原出处所有，内容为作者个人观点，并不代表本公众号赞同其观点和对其真实性负责；若您发现图文内容（包含文字、图片、表格等）对您的知识产权或者其他合法权益造成侵犯，请联系我们删除。用户使用或无法使用本公众号平台传递的信息所造成的所有直接或间接损失，本公众号平台不承担任何法律责任。在法律许可范围内，宁波新芝生物科技股份有限公司享有最终解释权。

阅读2次

关注