小囊泡大作用之孕妇篇
小编最近在产科轮转,看到好多伟大的准妈妈们,小编不禁好奇万能的exo君在这些美丽的准妈妈中是否也在贡献自己的一份力量。之前已有研究表明exo君在细胞间的交流中起着重要的作用,大家都知道的是准妈妈们与自己宝宝间的交流是依靠一个母胎循环,那我们的exo君在这个母胎循环中又是否起到属于它的一个特殊作用呢?
众所周知的是,胎盘可以通过分泌一些可溶性因子来影响胎儿,胎盘及母体的代谢,但是除了这些可溶性调节物质,胎盘细胞(包括细胞滋养层细胞,合体滋养层细胞和胎盘间充质干细胞)也可以通过释放一些细胞外囊泡(ECVs—包括凋亡小体/囊泡(100–600 nm);脱落的微绒毛(.400 nm);微囊泡(0.1–2 mm);外泌体(30–100 nm)),从而对母体及胎儿产生影响。胎盘来源的ECVs(包括外泌体和微囊泡)在正常孕期的母体血浆中即可检测到,这些ECVs包含着胎盘特异性蛋白和miRNA,因此可能可与母体分泌的外泌体所区分开。
作者将研究对象分为四组,分别是非孕妇,怀孕妇女孕早期即头三个月(FT—first trimester, 孕6–12 weeks),怀孕妇女孕中期即中三个月(ST—second trimester, 孕22–24 weeks),怀孕妇女孕晚期即后三个月(TT—third trimester, 孕32–38 weeks),来检测这些人血浆中的外泌体。
Table 1. Clinical characteristics of patients and newborns.
所有被研究的妇女均为血压正常,没有宫内感染或其他医学方面疾病及产科方面的并发症。孕妇的平均年龄是27.83±6.1岁,平均BMI为24.95±4.2 kg/m2,胎盘重量平均是595±96g。婴儿出生时的平均体重是3435±459 g,男/女比例为0.53(1个男婴和13个女婴)
Figure 1. Characterisation of exosome from maternal circulation.
(A)超速离心(200,000xg)后,蔗糖梯度分离前;(B)蔗糖梯度分离后的部分1-4;(C)蔗糖梯度分离后的部分5-8;(D)蔗糖梯度分离后的部分9-10;(E)囊泡百分比(白色:代表蔗糖梯度分离前);(F)对外泌体标记物CD63, CD9, CD81进行WB,红框内代表的是外泌体的密度。(G)1为上清液超速离心后所得的电镜下图像,2为蔗糖离心后的外泌体部分(及外泌体富集部分5-8) Scale bar 100 nm.
纳米追踪分析从非孕妇及怀孕前三月,中三月,后三月的孕妇血浆中分离的外泌体,囊泡直径为50-200nm(Figure 1 A–D and table 2)。此外,在超速离心后,使用蔗糖梯度离心法获得一个外泌体富集部分,占离心所得的囊泡的70%(Figure 1E)。孕妇血浆外泌体的密度在1.126到1.187g/ml(fractions 5 to 8)。
Table 2. vesicles size distribution during pregnancy.
Figure 2. Exosome profiling across the pregnancy.
血浆外泌体蛋白质浓度在非孕妇中是平均0.03±0.01 mg(n =9)蛋白/ml,明显低于孕前三月的孕妇(0.61±0.14 mg protein/ml, n =20,p<0.001),且在孕中三月和后三月,外泌体蛋白浓度也是明显增加,分别是0.94±0.41和 1.40±0.11 mg/m(Figure 2A, ANOVA, p<0.003).孕妇血浆外泌体蛋白质浓度头三月明显少于中三月和后三月(p<0.05),但中三月和后三月并没有显着不同(p<0.05)。量化外泌体数量(number of exosome vesicles, NEV)和外泌体胎盘碱性磷酸酶(PLAP)浓度,在怀孕妇女中,NEV明显增加(ANOVA, p<0.001),且随着孕期进展增加。在中三月和后三月,NEV分别是头三月的4.8和13.5倍(Figure 2B).而非孕妇女血浆中的外泌体数量则明显低于妊娠妇女。
Figure 3. Placenta-derived exosomes profile during pregnancy.
随着孕期增加,孕妇血浆中胎盘来源的外泌体(通过外泌体中的胎盘碱性磷酸酶(PLAP)确定)也增加,头三个月99.8±5.3 pg/ml;中三个月397±23,后三个月731±35 pg/ml (Figure 3A).外泌体的PLAP在非怀孕妇女中则不能检测到。通过WB分析也是得到相同的结果(Figure 3B).
而婴儿性别,母亲体重指数(BMI),母亲年龄,母亲体重,母亲身高对外泌体数量及外泌体的PLAP无明显影响。
Figure 4. Contribution of placental derived exosomes into maternal circulation.
孕妇血浆中外泌体的PLAP浓度与胎盘重量有明显相关性(Spearman’s r = 0.68;p = 0.0001) (Figure 4A).此外,子宫多普勒分析发现怀孕时平均搏动指数与外泌体的PLAP呈负相关(Spearman’s r =20.62, p<0.0001) (Figure 4 B and C).
Figure 5. PLAP activity across the pregnancy.
外泌体PLAP浓度(pg/ml 血浆)和每毫升血浆中外泌体总数量(NEV/ml 血浆)到在孕期增加,且有显着的相关性(Spearman’s r =0.79,p<0.001; Figure 5A).
在孕期的头三月和中三月,NEV和外泌体PLAP的倍数变化是类似的,但在孕晚期即后三月,NEV/ml的增加是独立与外泌体PLAP。血浆PLAP在头三月和中三月是恒定的,但减少了四倍在后三月(Bonferroni’s multiple comparison test, p<0.001) (Figure 5C).。这些数据都说明了胎盘减少包含PLAP外泌体的释放量,或是增加了非胎盘来源的外泌体释放量,或是两者皆有。但具体是什么原因引起孕晚期外泌体PLAP的减少则不得而知。
Figure 6. Maternal exosome effects on endothelial cells migration.
使用实时细胞成像系统和人脐静脉内皮细胞(HUVEC),来确定孕妇在孕头三月(FT-exo), 中三月 (ST-exo)和后三月(TT-exo)循环来源的外泌体的作用。在图6A,B,C展示了100μg外泌体蛋白/ml对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的作用。发现与没有外泌体相比,来自FT, ST和TT的血浆外泌体分别增加了HUVEC 2.7倍,2.3倍,和1.87倍的迁移能力(Figure 6C)。来自非孕妇的外泌体与没有用外泌体处理相比,也增加了HUVEC 1.45倍的细胞迁移能力。可见exo-FT 和exo-ST对HUVEC 迁移能力的作用明显高于来自非孕期妇女的外泌体。外泌体的生物学功能在孕早期(头三月)最明显,随着孕期增加逐渐下降,这种生物学功能的改变可能反映了细胞起源的改变,和/外泌体的内容物的改变。
这篇文章第一次对孕妇外周血浆外泌体的改变进行特征化,并提供一个基线,将来可能可作为复杂妊娠评估的一个临床诊断。
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