大鼠原代肝细胞分离培养方法的改良

大鼠原代肝细胞分离培养方法的改良

摘要：本研究的目的是改进经典的Seglen原位两步胶原酶灌流法，建立稳定简便的大鼠原代肝细胞分离培养方法。采用胰酶消化获取大鼠肝细胞进行纯化、培养，过碘酸-雪夫反应（PAS）鉴定。结果显示，本法培养的肝细胞产量高、活力好，每只大鼠可获得约2×108个肝细胞；相差显微镜观察不同生长期的肝细胞，细胞贴壁后变平变薄，双核细胞呈岛状连接的形态学特性；PAS鉴定，肝细胞内由于含有大量的糖原颗粒而被染成红色。表明改良的方法稳定、高效，为进一步的实验研究奠定了基础。 
关键词：肝细胞；细胞培养技术；PAS；分离 


    体外肝细胞培养模型具有突出的优点，能接近生理状态研究药物和毒物的代谢及毒性，真实反应体内的代谢情况，排除体内其他因素的影响[1]。随着技术水平的不断提高，原代肝细胞培养越来越成熟，并广泛地用于毒理学、药理学、生物化学及致癌作用等研究。目前称为体外药物试验的“金标准”[2]。但肝细胞在体外增殖能力差，原代培养难以成功，故在一定程度上限制了肝细胞离体模型的广泛应用[3]。Seglen的原位两步胶原酶灌流法分离培养的肝细胞不仅数量多，纯度高，形态好，而且还保留肝细胞的功能，是分离培养大鼠原代肝细胞的经典方法[4]。但胶原酶法灌流装置昂贵，成本费用高，操作复杂等限制了该方法的广泛应用。本研究对该经典方法的进行了改良，建立了操作简便、成本低廉，不需要复杂设备的大鼠原代肝细胞培养模型。 
1  材料与方法 
1.1  动物   
SD大鼠，180～220g，雄性，清洁级，扬州大学医学院实验动物中心提供。 
1.2 试剂和仪器   
鼠尾胶原（自制）；Leibovitz-15培养基（Gibco）；胎牛血清（杭州四季青）；胰酶（生工生物工程有限公司，1:250）；碱性品红、偏重亚硫酸钠、过碘酸（上海生工）；青霉素、链霉素、胰岛素、地塞
米松（Sigma-alorich）；二氧化碳培养箱（美国Forma公司）；高速冷冻离心机（Jouan/MR23i）；TE 2000-U倒置显微镜（日本Nikon公司）；THZ82B气浴恒温振荡器（江苏金坛医疗仪器厂）；ZDX-35B型自控压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；YJ-875净化工作台（苏州金燕净化设备厂）； PS9000705超纯水制备装置（美国Labconco公司）；KJ-1型循环式多用真空泵（上海嘉鹏科技有限公司）； 
SUNRISE遥控酶标仪（美国TECAN公司）。 
1.3 肝细胞悬液制备   
参考Seglen[5]的两步胶原酶灌注法并作改动。取禁食24h的SD大鼠以2％戊巴比妥钠（40mg/kg.b.w）腹腔注射麻醉，腹腔注射肝素钠抗凝，固定于固定板上，腹部皮肤消毒，打开腹腔，分离并结扎门静脉和下腔静脉的远心端及上腔静脉，用连接于输液器的留置针从门静脉近心端插管，剪开下腔静脉近心端，结扎上腔静脉，用37℃ D-Hank，s液以流速为25ml/min开放灌流约10min，待肝脏变为土黄色后，改用37℃、含0.18％胰酶的D-Hank，s液以流速为25ml/min继续灌流10min（灌流过程中保持灌流液的温度为37℃）。停止灌流取出肝脏，用含双抗（青霉素100U, 链霉素100μg）的PBS清洗3次，含双抗、1％BSA的Hank，s液终止消化反应，去除肝包膜及血管等纤维结缔组织，收集肝细胞悬液，100目、200目的筛网过滤肝细胞悬液，700r/min离心5min，去除上清液，在沉淀中加入BSA液重悬，500 r/min离心5min，去上清，沉淀中加入L-15完全培养基（含10％胎牛血清、0.5 mg/L胰岛素、1.0×10-7mol/L 地塞米松），500 r/min离心5min。离心肝细胞3次以去除胰酶及非肝实质细胞。 
1.4 细胞形态学观察   
试验过程中用倒置显微镜对分离纯化和接种的肝细胞进行形态学观察并摄影。 
1.5细胞产量及活率的测定   
在显微镜下用血细胞计数板，通过白细胞计数的方法计算细胞产量；用体积分数为0.4％台盼兰与肝细胞悬液以V:V=1:9的比例混合。 
细胞活率＝未着色细胞/细胞总数 
1.6 肝细胞原代培养   
调整肝细胞悬液的密度，以2～6×105个细胞/ml接种于预先铺有尾胶原的培养板，37℃、5% CO2条件下培养。4h细胞贴壁后换用L-15完全培养基，去除死亡及未贴壁细胞，每隔24h换液。 
1.7 过碘酸-雪夫反应（PAS）鉴定肝细胞 
1.7.1 高碘酸氧化液配制  0.5g高碘酸溶于100ml蒸馏水中，4℃冰箱保存。 
1.7.2  Schiff剂配制  1g碱性品红溶于200ml煮沸的蒸馏水中，振荡5min，冷却至50℃过滤，并向滤液中加20ml 1mol/L的盐酸，冷却至25℃时加1g焦亚硫酸钠（Na2S2O5）。将此液置暗处12-24h，加2g活性炭，摇动1min过滤。保存于0-4℃，用时恢复室温。 
1.7.3  PAS糖原染色取出肝细胞爬片，用0.9％的生理盐水清洗两次，每次3min；70﹪酒精固定10min；高碘酸水溶液反应10min；流水冲洗，蒸馏水洗5min，晒干；置入Schiff试剂中10-30min后水洗3min；自然干燥后镜下观察。 
2 结果 
2.1 肝细胞形态学观察   
置于倒置显微镜下观察，低倍镜下可见活细胞呈光亮圆形，饱满，透光度好，胞核清晰（图1）。培养24h后可见细胞拉平变薄，体积增大，多呈双核细胞，部分细胞呈多边形展开，有些细胞开始呈岛状连接（图2）。 

 
2.2 肝细胞的产率及细胞活率   
终计数，平均每只大鼠肝获得2×108个肝细胞。用新分离的肝细胞做台盼兰排斥试验，结果显示细胞活率大于90%，活细胞的胞浆及核均排斥染色，整个细胞呈透亮无色(图3)。 
图3  台盼兰染色的肝细胞，100× 
2.3 肝细胞鉴定 
PAS染色后，高倍镜下观察到新分离的肝细胞内由于含有大量的糖原颗粒而被染成红色（图4、图5）。 

 
图4   PAS染色的肝细胞， 100×                 图5  PAS染色的肝细胞， 200×   
3 讨 论 
长期以来，国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究，但要获得高活率、功能好的肝细胞，至今仍非易事。早期主要用非酶法分离肝细胞,包括机械法(如匀浆法)及螯合法。Hills[6]等（1961）最早运用机械法分离了人胚肝细胞。但机械法对肝细胞损伤大，细胞活率低；螯合法是用可结合Ca2+、Mg2+的螯合剂(如枸橼酸盐或EDTA)分离肝细胞，但螯合剂单独使用效果不好，常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞，包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。Howard[7]等（1968）用胶原酶消化肝脏薄片；Berry[8]等（1969）首次建立在生理条件下用胶原酶及透明质酸酶灌注肝的方法，大大提高了肝细胞产量及活力，为酶灌注法奠定了基础。随后，Ingebretsen[9]等单用胶原酶灌肝也获得同样的效果。Seglen[5]（1976）在前人方法的基础上建立了两步原位灌流法，这是目前国际上流行的肝细胞分离方法。先从门静脉用无钙、含氧前期缓冲液，冲出血细胞和钙离子，再换含蛋白水解酶的溶液至组织软化。此法分离获得的肝细胞几乎为纯的肝实质细胞，不仅数量多，活性高，而且保留了肝细胞的各种功能。但该方法使用的胶原酶及灌流装置的价格昂贵[10]，操作环节多，技术要求高，所需时间长，易污染[11]，限制了该方法在一般实验室的应用。 
为了克服上述缺点，经过反复实验，对Seglen法在以下几个方面作了改进：（1）选用价格便宜的胰酶代替胶原酶进行灌注，获得的肝细胞存活率大于90%，与胶原酶灌注结果相近似；（2）灌流装置使用输液器、直径为1mm的留置针，比经典方法方便易得，费用便宜；（3）选用L-15培养液替代William’E培养液，在L-15培养液中加入胎牛血清、胰岛素、地塞米松、配成完全培养基[12]，使用该培养基培养的细胞贴壁后变平变薄，双核细胞呈岛状连接，形态良好；（4）使用经过自制尾胶原预处理的培养板接种细胞，贴壁效果更好。 
此外，经过反复实验证明，在整个灌注过程中灌流液的温度保持为37℃，消化效果会更好，获得的肝细胞数量多，平均每只大鼠取得的肝细胞数量可达2×108个。成纤维细胞和红细胞等污染以及细胞碎片对肝细胞的培养影响很大，因此对肝细胞进行纯化是肝细胞培养的关键，而肝细胞的密度较成纤维母细胞、红细胞及细胞碎片的密度大，故采用梯度离心的方法获得纯度较高的肝细胞，本研究证明在第1、2次离心时使用1％的BSA液重悬细胞，可使获得的肝细胞活率更高。 
本研究建立的大鼠原代肝细胞培养模型简便易行、价格低廉，且分离的肝细胞数量多，纯度高，接种后2～4h内即可呈单层紧密排列贴壁生长，并在一定的体外培养条件下仍保留许多体内的细胞功能和活性，可在一般实验室推广。 
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