什么是蛋白质转运?
除了少量的蛋白质由线粒体和叶绿体 dna 编码外,其余蛋白质都是由细胞核 dna 编码,在细胞质游离/吸附的核糖体上合成。
细胞要发挥正常功能,必须使每一个蛋白质都要在膜(细胞膜,细胞器膜)或水相腔室(细胞质,细胞器基质或内膜腔)中正确定位。
如受体蛋白、离子通道蛋白和转运蛋白需要嵌在质膜内。dna、rna 聚合酶需要运送到核里。蛋白酶和过氧化氢酶应分别转运至溶酶体和过氧化物酶体。其他如细胞外间质和激素则需要分泌到细胞外。
也就是说蛋白质转运是
* 细胞内将新合成的蛋白分类,修饰并运输到正确目的地的过程。
* 可以将蛋白质转运形象化类比为街道上移动的交通工具:多方向运动,遵守交通规则,高度动态,每个都具有一个最终目的地。
* 蛋白质转运/蛋白质定位/蛋白质分发,这三个术语在文献中是可以互换的。 蛋白质转运主要有两条路径:内吞和外泌。
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为什么要研究蛋白质的转运?
* 帮助我们了解细胞稳态的关键机制,蛋白质-蛋白质相互作用,翻译后修饰和细胞间的相互作用。
* 解释人类疾病发病机理,如亚细胞蛋白质转运发生错误,将会发生「转运异常疾病」,目前为止,已经发现超过 30 种转运异常疾病,囊性纤维病是最具代表性之一。这些疾病包括但不仅限于代谢、神经病变和癌症疾病。
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如何研究蛋白质转运?
研究方法主要有以下几类
* 放射自显影(脉冲追踪 + 电子显微镜)
* 绿色荧光蛋白(gfp)+ 显微镜检查
* 突变体 + 绿色荧光蛋白(gfp)
* 生化分析和无细胞系统
* 亚细胞结构分离 + western,ip,交联质谱技术(xl-ms)
其中亚细胞结构分离 + western,ip,交联质谱技术(xl-ms)是目前最常用的方法。
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亚细胞结构分离方法研究蛋白转运应用举例
example a. ulbp2 trafficking blockage
leung wh., et al (2015)。 j. of immunol., spin column-based fractionation.
leung 等人[1]研究 prl-3 对 ulbp2 蛋白转运的影响。人结肠癌细胞系 hct116 使用 40um prl-3 处理,然后使用离心管柱法进行亚细胞结构分离。
结果显示,细胞质膜,细胞器和细胞浆组分被彻底分离,经过化学处理后的细胞导致 ulbp2 从细胞膜迁移到细胞器组分,而各组分中其他蛋白质在 prl-3 处理前后无明显变化。
example b. hiv gag protein trafficking
butluay et al cell. (2014), spin column-based fractionation.
kutluay 等人[2]研究 hiv-1 病毒颗粒组装过程中 gag-rna 复合体的分布及变化情况。实验中关键步骤之一是证明在不同亚细胞结构中 gag-rna 复合体表现出不同形式。
用 hiv-1 病毒质粒转染 4su-fed 293t 细胞后,通过离心管柱法进行亚细胞结构分离,分离后的细胞浆和细胞膜组分进行 western 印迹和免疫沉淀实验。
结果表明,胞浆中的 gag 蛋白主要是单体形式,而细胞质膜上的 gag 蛋白是多聚体形式(图 b)。这一结论很大程度上取决于细胞浆和细胞质膜组分的彻底分离(图 a)。
example c. isolated plasma membrane shows clearer signals
kashiwagi y. et al. plos one (2015) , spin column-based fractionation.
大部分质膜蛋白为低丰度表达,没有经过分离和富集时很难检测和定量。上图数据[3]显示质膜蛋白富集后对灌注后小鼠心脏样品中 sglt1 检测效果的影响。与总膜部分相比,sglt1 和质膜蛋白内参 na+/k+ atpase 信号在质膜蛋白组分中都有显着的增强。
example d. distribution of target proteins
georgiou d. k. et al. jbc (2015), spin-column-based fractionation.
georgiou 等人[4]研究钙离子通道复合物 cav1.1 调控脂肪酸转运蛋白 cd36 分布和脂肪酸代谢。cav1.1 e1014k 基因敲除小鼠(ek)和野生小鼠(wt)的肌肉组织样品,通过离心管柱法进行亚细胞结构分离,分离后的细胞浆,细胞核,细胞膜以及纯化的线粒体组分进行 western 印迹检测 cd36 的表达及分布情况。
lamin a,gapdh 及 vdac 分别为细胞核,细胞浆及线粒体组分的内参。结果表明,与 wt 相比,ek 小鼠的 cd36 在细胞浆组分中增加,在质膜组分中减少。其它膜蛋白(enos,cav1.1,ryr1)则无明显变化。
example e. cell fractionation and ip
devarakonda et al. bmc cancer (2015) 15:614, spin-column-based fractionation.
devarakonda 等人[5]研究乳腺癌患者细胞 hsp90 蛋白与重链抗体(hcab1 及 hcab2)靶向结合。乳腺癌样品通过离心管柱法进行亚细胞结构分离,分离后用细胞浆和细胞膜蛋白进行 ip 实验。
结果表明只有 hcab2 可在细胞浆中沉淀内源 hsp90 及重组蛋白(hsp90beta),hcab2 也可在细胞质膜中沉淀内源 hsp90。
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亚细胞结构分离的常用方法有哪些?
1. 蔗糖密度超高速离心分离法
传统方法进行亚细胞结构分离是通过蔗糖密度超高速离心分离[6,7],操作方法十分繁琐和耗时并且需要较大样品量。 通常需要几个小时甚至几天才能完成。步骤复杂,需要特殊设备仪器,自配溶液,以及需要优良的操作技术。
2. 表面活性剂提取法
大部分商业试剂盒属于这类方法。可将细胞分为两大组分:胞浆蛋白和总膜蛋白,但无法单独提取质膜蛋白组分,下游无法进行蛋白互作类研究。
3. 离心管柱法亚细胞结构分离法
你可能不知道,离心管柱法是新一代的亚细胞结构分离技术。离心管柱法亚细胞结构分离无需匀浆仪和超高速离心机,简单而快速。
细胞/组织样品首先通过一个特制的离心管柱,在这个过程中细胞膜会被破裂,完整的细胞核,细胞器,质膜和胞浆蛋白被释放到溶液中,之后进一步分离成五个组分:细胞核,细胞浆,总膜,细胞器,质膜。
使用离心管柱和独特的缓冲系统配合,可以获得高回收率,低交叉污染的天然亚细胞结构蛋白,整个操作不到一小时即可完成。
分离出的天然亚细胞结构蛋白可以用于任何下游实验,离心管柱法也可用于植物样品亚细胞结构的分离。点击「阅读原文」即可了解更多相关内容。
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