逆转录pcr(rt-pcr)在实验室中经常被用于检测和量化样本中的rna表达。实验的第一步是通过逆转录(rt)将不稳定的rna转化为互补的dna(cdna)。实际上,rt是许多用于研究rna的分子生物学技术的第一步,因为将不稳定的rna转换为更稳定的dna会使分析更容易、更可靠。对于rt-pcr,有一步法和两步法。
在一步法rt-pcr中,rt反应和pcr扩增是在同一管中进行。将rna模板添加到试管中,加有两种酶(逆转录酶和dna聚合酶),以及完成反应的所有必须组分。逆转录酶产生cdna产物,然后逆转录酶和cdna变性,dna聚合酶扩增cdna。在一步法中,rt反应由基因特异性引物启动。因此,只有感兴趣的区域被反向转录,然后进行扩增。
在两步法rt-qpcr中,rt反应与pcr扩增单独进行。首先,rna添加到反应混合物中,混合物包括逆转录酶和oligo-dts (结合mrna的poly-a尾巴)或随机六聚体(或两者都有),合成cdna。下一步,从管子中取出少量cdna,置于一个新管中,作为pcr的模板与基因特定的引物一起混合。因为rt反应采用随机启动或由oligo-dts进行启动,总rna或总mrna在rt步骤中被转录。尽管这两种方法都能得到最终的结果,但是每种方法都有优缺点。选择哪种方法取决于各种因素。如下总结它们的优缺点。
一步法rt-pcr:
优点: 只需一步,反应发生在单管中,速度比两步法更快,而且需要较少的准备和操作时间。
处理大量样品时易于操作,减少污染的机会。
整个cdna样品都被扩增,灵敏度更高。
缺点: 同一样本只有有限数量的目的基因被扩增。另一个挑战是组分的兼容性,因为一步法需要转录和扩增之间的平衡。
适用性:当时间对于实验很重要时,一般采用一步法。例如,迅速的一步法是rna病毒检测的好方法,结果可以很快得到。也适用于高通量分析。 由于该方法采用基因特异性引物,所以通常是分析低表达水平基因的较好选择。此外,一步法是非常精确的,需要测量表达水平上的细微差异时这是一种常用的方法。
两步法rt-pcr:
优点: 可以分析同一样本的多个目标。
逆转录步骤将样本中所有的rna转换为cdna,可以储存cdna用于后续实验,检测大量基因。
能够分别优化rt和pcr步骤,可以更好地控制实验过程。
因为只有少量的转录材料用于pcr,任何可能从rna分离到rt反应的抑制剂(如乙醇、苯酚或胍盐)都被稀释了。
缺点:它更耗费时间,且带来污染的可能性更高。rt步骤转录所有的rna以相同的效率,选择这种方法时,应该考虑到启动会影响qpcr的结果。例如,以oligo-dts 和随机六聚体启动反应可能会带来不同的结果。因此,对于每个rt反应应该使用相同的条件。
适用性:选择两步方法的最常见原因是对同一样本的多个目标进行分析。第二,当rna的存储是个问题时,最好是进行两步rt-pcr,因为cdna在-20°c是稳定的。此外,当起始材料有限时,使用两步rt-pcr ,通常会有更高的cdna产量。
实战分享|小鼠淋巴细胞的提取和分选之经验小结
实战分享 | 原生细胞的合成之经验分享
实验常用人肝癌细胞株(HepG2/Hep3B,HuH-7,MHCC97H,PLC/PRF/5)怎么选
原代细胞的培养方法及注意事项
相关产品
GelstainRedTM 核酸染料, 10,000× in water
Super GelBlueTM 核酸染料, 10,000× in water
彩色预染蛋白Marker(10-180 kDa,三色)
彩色预染蛋白Marker(10-250kDa, 双色)
琼脂糖 A2015
Super ECL Plus(超敏化学发光检测试剂盒) S6009M
PAGE 彩色快速凝胶制备试剂盒(10%)
Minerva Super Fusion Cloning Kit(无缝克隆试剂盒)
Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖检测试剂盒
FITC-Annexin V/PI 细胞凋亡试剂盒
1,5-AG(1,5-Anhydroglucitol) ELISA Kit XY9U2590
Recombinant Tyrosine 3/Tryptophan 5 Monooxygenase Activation Protein Theta (YWHAq) XY95200RPHu01
Recombinant Spindlin 1 (SPIN1) XY94760RPHu
OVA Conjugated Leucine (Leu) XY95654CPSGe
Recombinant Peroxiredoxin 5 (PRDX5) XY93776RPMu02
关注
拨打电话
留言咨询