内源性大麻素在异丙酚预处理致心脏保护效应中的作用研究
背景:心肌梗死是日常和手术后患者的头号死因。随着治疗的进步,梗死后再灌注损伤的防治成为最大障碍。在围手术期,麻醉医生对心肌缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury,IRI)的及时准确处理,将有助于改善患者的预后。研究发现,静脉麻醉药异丙酚(propofol)预处理(preconditioning)具有心脏保护作用,机制与抗氧化、调节ROS/NO信号通路、炎症和免疫调节、激活保护性信号通路等相关,但特异性靶点和上游激活分子仍不清楚。内源性大麻素(endocannabinoids)系统在心脏本身、循环系统和神经内分泌系统都广泛存在,能够调节心脏缺血再灌注损伤。异丙酚可抑制内源性大麻素降解酶——脂肪酸酰胺水解酶(FAAH),提高内源性大麻素水平。本研究拟研究内源性大麻素系统在异丙酚预处理致心脏保护效应中的作用和机制。第一部分异丙酚对心肌内源性大麻素系统的影响目的:内源性大麻素系统包括内源性大麻素、大麻素受体(CB1R、CB2R、TRPV1、新型血管型GPCR等)和代谢相关蛋白和酶类。本研究旨在观察:(1)异丙酚预处理能否减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤;(2)异丙酚对基础条件下和缺氧/复氧后心肌细胞内源性大麻素(AEA和2-AG)释放的影响;(3)异丙酚预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤后外周血AEA和2-AG水平的影响;(4)异丙酚预处理对缺氧/复氧后心肌细胞CB1R和CB2R受体表达影响。方法:实验一、观察异丙酚预处理对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后细胞凋亡和内源性大麻素系统代谢的影响。采用课题组改良乳鼠心肌细胞培养方法,缺氧12小时/复氧4小时,建立心肌细胞缺氧/复氧模型。实验分为四组:control(对照组);propofol(单纯给予异丙酚孵育);H/R(缺氧/复氧组);propofol+H/R(异丙酚预处理组,异丙酚50μM,缺氧前1小时开始孵浴至缺氧结束)。观察指标:细胞凋亡率(流式细胞仪Annexin V/PI法)、细胞培养液ECs水平(包括2-花生四烯酸甘油(2-arachidonoylglycerol,2-AG)和N-花生四烯酸氨基乙醇(anandamide,AEA),UPLC-MS/MS法测定细胞培养液2-AG和AEA浓度)、ECs受体CB1R、CB2R mRNA(Real-time PCR)和蛋白质水平(Western Blot)情况。实验二、观察异丙酚预处理对心肌缺血再灌注损伤后外周血内源性大麻素水平的影响。采用结扎大鼠冠状动脉左前降支致心肌缺血再灌注损伤模型。异丙酚预处理方式为缺血前1小时,首先静脉注射10mg/kg异丙酚,后39mg/kg·hr静脉持续泵注。实验分sham(假手术组)、propofol(单纯给予异丙酚)、i/r(缺血/再灌注损伤组)和propofol+i/r(异丙酚预处理组)四组,观察外周血内源性大麻素水平的变化(uplc-ms/ms法)。结果:实验一、异丙酚预处理能够减少缺氧/复氧后心肌细胞凋亡。缺氧/复氧后,心肌细胞释放aea和2-ag短暂增加。异丙酚预处理能够增加细胞培养液中内源性大麻素水平。缺氧/复氧可导致心肌细胞cb1r、cb2rmrna和蛋白质水平升高,异丙酚对此无影响。实验二、异丙酚缺血前预处理升高大鼠心肌缺血再灌注损伤后外周血aea和2-ag浓度,但维持时间短暂。结论:异丙酚预处理能够减少心肌细胞缺氧/复氧损伤,并促进离体和在体心肌缺氧/缺血后内源性大麻素的释放。第二部分调控内源性大麻素代谢对异丙酚预处理致心肌细胞保护的影响目的:通过给予内源性大麻素降解酶faah抑制剂urb597或转运抑制剂vdm11提高内源性大麻素水平,观察异丙酚预处理的心肌保护效应是否依赖于心肌细胞内源性大麻素水平的升高。方法:采用心肌细胞缺氧/复氧模型,实验分为八组:control、propofol、h/r、propofol+h/r、faah抑制剂urb597+h/r(单纯给予1μmurb597预处理,缺氧前1.5小时孵育至缺氧结束)、urb597+propofol+h/r、内源性大麻素转运抑制剂vdm11+h/r(单纯给予1μmvdm11预处理,缺氧前1小时孵育至缺氧结束);vdm11+propofol+h/r。观察指标:细胞活力(cck法)、细胞凋亡、细胞培养液ldh浓度、氧化损伤情况(mda、sod)、活性氧簇ros水平(h2dcfda+流式细胞仪检测)、no水平(daf-fmda+流式细胞仪检测)。结果:异丙酚预处理能够减轻缺氧/复氧导致的心肌细胞活力下降和细胞凋亡,并可减少ldh漏出。较缺氧/复氧组,异丙酚可降低细胞mda浓度,升高sod浓度,并降低细胞ros和no水平。urb597或vdm11预处理能够减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤。异丙酚和urb597、异丙酚和vdm11在减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤方面不存在协同作用。结论:提高内源性大麻素水平有助于减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤,异丙酚心肌细胞保护效应依赖于内源性大麻素的释放。第三部分异丙酚预处理心肌保护效应的大麻素受体机制目的:通过给予大麻素受体CB1R、CB2R特异性抑制剂,观察异丙酚心脏保护效应是由哪种受体介导的。方法:采用大鼠结扎冠状动脉左前降支致缺血再灌注损伤模型,研究分为七组:sham、I/R(单纯缺血再灌注损伤组)、propofol+I/R、CB1R拮抗剂AM251+I/R(AM251预注射组,缺血前1.5小时静脉注射,1mg/kg)、AM251+propofol+I/R、CB2R拮抗剂AM630(AM630预注射组,缺血前1.5小时静脉注射,1mg/kg)、AM630+propofol+I/R。观察指标:心肌梗死面积(Evans blue+TTC染色法)、组织病理学检查、心肌损伤酶cTn I、氧化损伤指标(外周血MPO和SOD)、炎症损伤指标(外周血IL-1β、TNFα、sICAM-1、IL-10)。结果:异丙酚预处理可减少心肌梗死面积,降低cTn I水平、降低外周血MPO、IL-1β、TNFα、sICAM-1水平,升高SOD和IL-10浓度。AM251预处理具有轻微的心肌损伤改善作用,不能对抗异丙酚的心肌保护效应。AM630预处理加重心肌缺血再灌注损伤,且能够逆转异丙酚的心肌保护效应。结论:异丙酚预处理主要通过大麻素CB2R发挥心脏保护效应。
实战分享|小鼠淋巴细胞的提取和分选之经验小结
实战分享 | 原生细胞的合成之经验分享
实验常用人肝癌细胞株(HepG2/Hep3B,HuH-7,MHCC97H,PLC/PRF/5)怎么选
原代细胞的培养方法及注意事项
相关产品
GelstainRedTM 核酸染料, 10,000× in water
Super GelBlueTM 核酸染料, 10,000× in water
彩色预染蛋白Marker(10-180 kDa,三色)
彩色预染蛋白Marker(10-250kDa, 双色)
琼脂糖 A2015
Super ECL Plus(超敏化学发光检测试剂盒) S6009M
PAGE 彩色快速凝胶制备试剂盒(10%)
Minerva Super Fusion Cloning Kit(无缝克隆试剂盒)
Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖检测试剂盒
FITC-Annexin V/PI 细胞凋亡试剂盒
1,5-AG(1,5-Anhydroglucitol) ELISA Kit XY9U2590
Recombinant Tyrosine 3/Tryptophan 5 Monooxygenase Activation Protein Theta (YWHAq) XY95200RPHu01
Recombinant Spindlin 1 (SPIN1) XY94760RPHu
OVA Conjugated Leucine (Leu) XY95654CPSGe
Recombinant Peroxiredoxin 5 (PRDX5) XY93776RPMu02
关注
拨打电话
留言咨询