近日广东省食药监抽检网购面膜发现,超过20%的面膜中非法添加了糖皮质激素,这种被称为“皮肤鸦片”的物质是一类甾体激素,依据《化妆品卫生规范》中提到这类物质是严禁违法滥用添加于化妆品,若将其作为细嫩美白肌肤的功效成分,其会破坏人体激素平衡,如果长期使用,人体皮肤会产生激素依赖症状,停用后反而会加重皮肤过敏,出现红斑、丘疹、毛细血管扩张等严重问题,激素依赖性皮炎发病只需要大约两周时间,但是治疗起来却是一个漫长而棘手的过程。
作为实验室综合供应商的广州绿百草整理了一些仪器公司针对GBT 24800.2-2009化妆品中四十一种糖皮质激素的测定——液相色谱串联质谱法和薄层层析法的全年解决方案进行了汇总,以便广大检测单位以及人员参考。
实验过程用到的整套标准品如下:
化妆品中 41 种糖皮质激素类药物的测定
样品前处理
称取 0.2 g 样品,加入3 mL饱和食盐水和2 mL乙腈(2次)涡旋(IKA Vortex Genius 3)提取目标物。合并二次提取的 4 mL 乙腈,加入 40 mL 水、0.2 mL亚铁氰化钾、0.2 mL 醋酸锌,混匀后 5000 rpm 离心 10 min。上清液倒入 Bond Elut Plexa 聚合物小柱 60 mg/3 mL(上接 50 mL磨口漏斗),按固相萃取净化过程获得液质上机液。
色谱和质谱条件
仪器: 1260Infinity 液相色谱/6410三重四极杆液质联用系统
色谱柱:ZORBAXSB-C18,2.1 × 50 mm,1.8 μm,
部件号 827700-902
进样量:2μ-L
流动相: A) 含 0.1% 乙酸的水溶液
B) 含 0.1% 乙酸的乙腈溶液
梯度洗脱:
时间/min %B
0 32
3.0 32
12.0 75
14.0 75
14.1 32
流速:0.3 mL/min
柱温:30℃
分离时间:16 min
离子源:ESI
干燥气流量:5 L/min
干燥气温度:350℃
雾化器压力:38 psi
化妆品剂型多样、基质复杂,所涉及的 41 种糖皮质激素的药效从弱效、中效、强效到超强效,分子特征为 17 碳原子环戊烷并多氢菲母核上具有不同基团的修饰,差异较大。从化妆品中完整提取并纯化出数十种待测目标物,并进一步建立多组分色谱分离、质谱测定仍有很多困难。因此,好的样品前处理方法非常关键。本文中使用的 Bond Elut Plexa 小柱,具有纯化效果好、回收率高、流速快的特点,可以很好的用在大批量样品检测中,可作为化妆品中 41 种糖皮质激素检测的参考方法。
TSQ Quantum Access Max三重四极杆液质联用系统同时定量化妆品中41种糖皮质激素
仪器方法
色谱系统:Accela 600快速液相色谱系统
色谱柱:Hypersil Gold C18(50×2.1mm, 1.9μm)
流动相:水(含0.1%甲酸)/乙腈(含0.1%甲酸)
流速:400μL/min;
进样量:10μL
梯度条件:
质谱系统:TSQ Quantum Access Max三重四极杆
质谱条件:
离子化方式:HESI-Ⅱ
极性模式:正离子
雾化温度:300℃
鞘气:40 arb
辅助气:15 arb
离子传输管温度:300℃
质谱扫描参数:
扫描方式:t-SRM
扫描循环时间:0.3 s
分辨率:Q1分辨率分别设置为0.4和0.7 FWHM
标准曲线样品及基质样品的配制
取含41种糖皮质激素的混合对照品溶液,各组分浓度均为0.5 μg/ml,稀释至0.5ng/mL、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml,作为标准曲线工作样品。分别取空白爽肤水及精华液基质溶液,过滤膜后,配制成含20%乙腈的基质溶液,并以此基质溶液稀释样品至0.1ng/mL和0.5ng/mL。
结果与讨论
色谱条件的优化
色谱柱的选择:分别考察了Hypersi l Gold C18 (50×2.1mm, 1.9μm)和Hypersil ODS C18(10×2.1mm, 3μm) 2根规格不同的C18色谱柱对41种激素成分的分离效果。结果表明,前者对41中组分中色谱保留行为非常相似的物质能实现更好的分离,且由于前者粒径小,能获得更高的柱效。同时,由于Accela 600液相泵系统耐压能力强,可使用高流速而大大减少色谱分离所需时间。
流动相及洗脱条件的选择:分别考察了甲醇/水(0.1%甲酸)、乙腈/水(0.1%甲酸)等流动相系统对于41种激素成分的分离效果。结果表明,采用乙腈(0.1%甲酸)/水(0.1%甲酸)系统进行梯度洗脱更有利于41种激素的色谱分离。考虑到化妆品基质的影响,延后目标组分的保留时间可减小基质的干扰,因此降低初始流动相中乙腈的比例至20%,得到的谱图。
质谱条件的优化
根据待测糖皮质激素分子结构及参考国标[12] ,选择ESI(+) 作为离子化模式 ,将0.5μg/ml的标准液通过蠕动泵连续进样,由TSQ Tune质谱参数优化软件自动获得最佳的子离子、碰撞能量及透镜电压。最终所选择的母离子、特征离子和碰撞能量详见表 1。图3为部分糖皮质激素的提取离子流图(0.5ng/mL)。附表1:离子对信息:母离子、特征离子、碰撞能量和扫描时间。
方法学考察
灵敏度及线性:将标准曲线样品(0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml 、25ng/ml、50ng/ml 、100ng/ml)依次进样,以峰面积对浓度绘制标准曲线,各激素成分在0.5-100ng/ml范围内的线性相关系数大于0.99(见表2);基质中各种激素的最低检出限为0.1ng/ml,最低定量限为0.5ng/mL。精密度:取0.5ng/ml基质加标溶液重复进样5次,各色谱峰保留时间稳定,精华液基质中各组分峰面积的RSD≤9.74%(见表2);爽肤水基质中各组分峰面积的RSD≤9.77%(见表2)。结果表明该方法稳定、可靠。
不同分辨率设置对方法灵敏度的影响以精华液基质样品为例,考察仪器分辨率设置对灵敏度的影响:下图中同行左侧色谱图为0.7FWHM条件下获得,右侧为0.4FWHM条件下获得。
实验结论
本实验应用TSQ Quantum Access Max三重四极杆液质联用系统,建立了41种糖皮质激素同时测定的方法,以基质样品为主考察了方法的灵敏度及重现性,同时考察了仪器不同分辨率设置对化合物检测的影响。本方法对化妆品基质中41种糖皮质激素的定量下限为0.5ng/mL,最低检测限可达0.1ng/mL。通过提高Q1的分辨率能有效降低基质干扰,提高部分化合物的灵敏度。分别以爽肤水空白基质、精华液空白基质与对照液进样比较,由色谱图可看出所建立的方法特异性高,能用于化妆品中41种糖皮质激素的检测。分别在爽肤水基质、精华液基质中添加41种糖皮质激素,浓度均为0.5ng/mL,各连续重复进样5针方法重现性良好。TSQ QuantumAccess Max三重四极杆液质联用系统配有可加热的电喷雾电离源、聚焦离子束的透镜组件、90度弯曲碰撞池等,可有效提高信号响应,并降低中性噪音,是化妆品中痕量非法添加成分检测的最佳选择。
本方法采用TSQ Quantum Access Max三重四极杆质谱系统,建立了同时定量爽肤水和精华油中41种糖皮质激素的液质联用法,最低定量限为0.5ng/ml,检测限为0.1ng/ml。该方法简便、快速、特异性强且灵敏度高,可应用于化妆品的实际检测。
最后附上原GBT 24800.2-2009国标中推荐用到的仪器耗材清单:
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