1、细胞或组织加Trizol后,室温放置5min,使其充分裂解。注:此时可放入-70℃长期保持。
2、12,000rpm 离心5min,弃沉淀。
3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿,振荡混匀后室温放置15min。注:禁用漩涡振荡器,以免基因组DNA断裂。
4、4℃ 12,000g离心15min。
5、吸取上层水相,至另一离心管中。注:千万不要吸取中间界面;若同时提取DNA和蛋白质,则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA,则弃下层酚相。
6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀,室温放置5-10min。
7、4℃ 12,000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底。
8、按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇,温和振荡离心管,悬浮沉淀。
9、 4℃ 8,000g离心5min,尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥5-10min。 注:RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。
11、可用50ul H2O,TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品,55-60℃,5-10min。注:H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。
12、测O.D值定量RNA浓度。注:此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间;产率估计:组织标本:(ug RNA/mg组织)1-10ug,培养细胞(ug RNA/106 Cell):5-15ug。
注:组织或细胞量过少,可酌情减少Trizol用量;组织或细胞用量过多,会引起DNA对RNA的污染;
高蛋白、脂肪或多糖类组织,肌肉组织或块状植物组织等,组织匀浆或液氮研磨后须4℃ 12,000g离心10min去掉不溶物,再进行下面操作,若顶层有脂肪物,则也须去掉;
热天提RNA,带手套是必须的,手是RNase的主要来源;
组织块用液氮研磨,效果最好,若没有液氮或电动匀浆器,可用手动匀浆器代替,此时组织块不宜过大,且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎,然后再充分研磨。
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