远慕生物:核蛋白的提取方法

上海远慕生物科技有限公司

2018/08/29 15:13

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柱式法 Minute TM 胞质胞核分离试剂盒操作方法：

A．悬浮细胞样品（包括植物，细菌，酵母和真菌制备的原生质体）

1.500Xg，3 分钟低速离心收集细胞，用预冷的 PBS 清洗一次

2. 将细胞转移到 1.5 ml 离心管中，3000 rpm 离心 1-5 分钟，弃去上清。

3. 按表格 1 加入适量的胞浆提取缓冲液（请注意样品及裂解液的比例，以达到最佳效果）, 涡旋大力震荡 15 秒, 冰上孵育 5 分钟, 混匀. 接转胞质胞核分离步骤。

表格 1，不同细胞体积应加入相应体积缓冲液

细胞体积（ul）	胞浆提取缓冲液（ul）	胞核提取缓冲液（ul）
5	50	25
10	100	50
20	200	100
50	500	250

﹡ NIH3T3 和 293T 细胞 10ul 体积相当于 1*10⁶ 个细胞

B. 贴壁细胞

1. 贴壁细胞生长至融合度 90-100%，将预冷的 PBS 直接加入细胞培养板，培养皿或培养瓶中清洗细胞两次，吸去上清。

2. 按表格 2 将适量的胞浆提取缓冲液均匀的加入整个器皿表面，冰上静置 5 分钟。用吸头吹打几次后转移到预冷的 1.5 ml 离心管中。涡旋大力震荡 15 秒。接转胞质胞核分离步骤。（请注意样品及裂解液的比例，如浓度较低请减少裂解液使用量）

表格 2，不同贴壁细胞量应加入相应体积缓冲液

器皿	胞浆提取缓冲液（ul）	胞核提取缓冲液（ul）
24孔板	80	25
6孔板	300	150
25 cm²培养瓶	500	250

C．组织样品

1. 称重适量组织样品，放入预冷的 1.5 ml 离心管中。

2. 用预冷的 PBS 清洗组织样品一次。3000rpm 离心 1 分钟，弃去上清，尽可能的使沉淀干燥。

3. 按表格 3 加入适量胞浆提取缓冲液，用微型管杵或微粉碎机匀浆，去除没有完全匀浆的组织碎片。接转胞质胞核分离步骤。

表格 3，不同组织样品量应加入相应体积缓冲液

组织样品（mg）	胞浆提取缓冲液（ul）	胞核提取缓冲液（ul）
5	50	25
10-15	100	50
15-20	200	100
20-30	500	250

胞质胞核分离步骤

1. 4oC，最高速 (14000-16000 rpm) 离心 5 分钟

2. 将上清液（上清为胞浆组份）转移到一个新的预冷的 1.5 ml 离心管中。将沉淀（可选优化：用 0.5 ml 预冷 PBS 重悬，10000 rpm，离心 3-5 分钟清洗沉淀可以减少胞浆蛋白污染）中加入适量的胞核提取缓冲液，涡旋大力震荡 15 秒，冰上孵育 1 分钟。然后重复震荡 15 秒，冰上孵育 1 分钟四次。（如核蛋白提取浓度低，可适当延长每次孵育及震荡时间）

3. 迅速将核提取物转入到预冷的离心管套管中，14000-16000 rpm，离心 30 秒。弃掉离心管柱。将核蛋白储存于-80℃。一般产量 1.5-2.5 mg/ml。

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