SDS PAGE又称聚丙烯酰胺凝胶电泳(英语: polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE) 作用:用于分离蛋白质和寡核苷酸。
SDS PAGE的配制方法
将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热(37℃左右)的去离子水中,充分搅拌溶解,补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质,储于棕色瓶,4℃避光(用铝箔纸包扎起来)保存。严格核实PH不得超过7.0,因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。如有沉淀,可以过滤。
10%(W/V, g/ml)过硫酸铵(APs)的配制:(100 ml)
1. 称取10g过硫酸铵;
2. 加入100 ml的去离子水,将固体粉末彻底溶解;
3. 贮存于4℃。
注意:10%过硫酸铵最hao现配现用,配好的溶液在4℃保存可使用2周左右,过期会失去催化效果。
5×Tris-Glycine电泳缓冲液的配制:(1 L)
1. 称取Tris粉末15.1 g、Glycine(甘氨酸)94 g、SDS 5.0 g;
2. 加入约800 ml的去离子水,搅拌溶解;
3. 加去离子水定容至1 L,室温保存。
注意:加水时应让水延着壁缓缓流下,以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。
5×SDS-PAGE Loading Buffer的配制(方案一):(5 ml)
(本方案摘自Takara网站)
组分:Tris-HCl? pH6.8(250 mM);SDS (10%);溴酚兰(0.5%);甘油(50%);β-巯基乙醇(5%)
配制过程:
1. 量取1M Tris-HCl (pH6.8) 1.25 ml;甘油2.5 ml;称取SDS固体粉末0.5 g;溴酚兰25 mg;
2. 加入去离子水溶解后定容至5 ml;
3. 小份(500 μl)分装后,于室温保存。
4. 使用前将25 μl的β-巯基乙醇加入到每小份中去。
5. 加入β-巯基乙醇的上样Buffer可以在室温下保存一个月左右。
5×SDS-PAGE Loading Buffer的配制(方案二):(10 ml)
(本方案摘自《蛋白质技术手册》汪家政、范明)
组分:Tris-HCl? pH6.8(60 mM);SDS (2%);溴酚兰(0.1%);甘油(25%);β-巯基乙醇(14.4 mM)
配制过程:
1. 量取1M Tris-HCl (pH6.8) 0.6 ml;50%的甘油5 ml;10%的SDS溶液2 ml;1%的溴酚兰1 ml;
2. 加入去离子水定容至10 ml;
3. 分装;
4. 在4℃可保存数周,-20℃可保存数月之久。
以上两种上样Buffer的配方不太一样,你还可以参考下面这个配方
2×SDS凝胶加样缓冲液 组分(摘自《分子克隆》第三版)
Tris-HCl? pH6.8(100 mM);SDS (4%);溴酚兰(0.2%);甘油(20%);β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(200 mM)
不含硫代试剂的加样Buffer可在室温保存。β-巯基乙醇或二硫苏糖醇临用前加入。
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