细胞解冻和培养指南
冻存的ATCC细胞株和杂交瘤细胞株在运送过程中使用干冰保持低温。收到冻存细胞后,可以立即解冻复苏,去除二甲基亚砜(DMSO)后进行细胞培养。如果不立即复苏培养细胞,必须将细胞冻存管放置于液氮罐气相层存储。请不要将细胞存储在-130℃以上的温度。如果温度不够低,达不到-130℃,细胞活力会迅速下降。
操作推荐
ATCC推荐在操作冻存的ATCC细胞株时使用手套,工作服和防护面具以避免任何事故发生。
检查包装,查看是否有任何破裂或渗漏。冻存的ATCC细胞株应处于固体状。
将冻存的ATCC细胞株从有干冰的包装中取出,立即复苏培养,或迅速转移放置在液氮罐气相层在-130℃以下的温度存储。
冻存细胞的复苏和培养
1、先准备好细胞培养皿或细胞培养瓶,及产品说明推荐的相应细胞培养基。并在37℃水浴中预先温热细胞培养基。(请参阅:注1)
2、小心取出装有细胞的冻存管,保持管盖拧紧,将冻存管盖以下的部分置于37℃水浴中并轻微的搅拌以帮助解冻。解冻过程应该尽快,大约短于2分钟或待最后一块小冰晶体刚融化,就应将细胞冻存管取出水浴。
3、在水浴中取出的细胞冻存管表面喷洒70%乙醇配制的消毒剂,用无菌纸巾或纱布拭干。之后的操作步骤都应该遵循在无菌条件下生物安全柜中严格操作。
4、小心拧开冻存管的顶部,将管内容物用1ml移液枪转移到含9毫升培养基的无菌离心管中。离心5到7分钟(125xg),小心吸去上清液以去除抗冻剂(二甲基亚砜),避免丢失细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于配好的完全培养基中。将细胞悬液转移到培养容器,轻轻摇晃使细胞均匀的分布。生长较慢的细胞株可重悬于5-8ml培养基并转移到T25培养瓶。生长较快的细胞株可重悬于12-20ml培养基并转移到T75培养瓶。
5、将细胞培养容器置于细胞培养箱,在温度37℃,二氧化碳浓度5%的培养条件下进行孵育。细胞培养24小时后应在显微镜下观察细胞形态和生长状况。(请参阅:注2)
*注1:虽然大多数细胞株可以在一种以上的培养基中生长,但细胞的特征有可能会在更换不同培养基时发生。为保证最佳效果,请从细胞培养一开始就使用ATCC推荐指定的培养基。
*注2:某些细胞株,如杂交瘤株,可能需要几天的时间才从冻存状态下完全恢复正常生长。在细胞复苏培养第1天可能会呈现较低的细胞活力并产生一些细胞碎片。度过这一时期后,细胞会恢复并进入指数增长期。
细胞培养贴士
细胞株的生长有两种状态,贴壁细胞需要附着在一个表面进行生长(贴壁依赖性),悬浮细胞可在悬浮培养状态下生长(非贴壁依赖)。在细胞单层贴壁生长货悬浮生长中,都通常遵循四个特征性阶段:迟滞期、对数或指数期、静止或平台期及衰退期。
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