问题 | 序号 | 可能原因 | 解决方法 |
显色淡,灵敏度偏低 | 1 | 试剂盒未充分平衡 | 试剂盒从2~8℃冰箱取出后打开盒盖,于室温平衡至少20分钟,确保所有试剂已平衡至室温(约25℃) |
2 | 样品不适合做ELISA检测 | 样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件(例如稀释液的成分) | |
3 | 酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥 | 防止板过于干燥 | |
4 | 包被抗体遭到破坏 | 操作温和,移液枪不能碰到孔底 | |
5 | 样本和抗体孵育条件不合适 | 按照说明书条件,建议孵育过程中全程振荡孵育。 | |
6 | 洗涤浸泡时间过长 | 按照说明书操作。勿人为增加浸泡时间; | |
7 | 偶联HRP试剂污染 | 弃去试剂,重新配置 | |
8 | 错误的稀释偶联HRP试剂 | 弃去试剂,重新配置 | |
9 | TMB底物孵育时间过短,因非人为因素影响,需要优化孵育时间 | 确定合适的孵育时间:人为判定-最高浓度的标准品出现深蓝色;S4-5有淡蓝色;机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65 | |
10 | 样本浓度过高或存在基质效应 | 建议做不同稀释倍数,确认样本最佳稀释倍数。 | |
11 | 酶标仪滤光片设置有问题或者波长选择不对 | 确认仪器设置及选择正确的波长检测。 | |
12 | 酶标板不适合做ELISA | 不能使用细胞培养板,建议使用ELISA专用高吸附力板子。 | |
背景深,全部呈有色(通常的Elisa背景值OD<0.2) | 1 | 洗涤不充分,洗后未拍干,样品中其它成分残留或酶标记物残留 | 洗液准确配制;充分洗涤,静置15秒,彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用,不要反复使用,否则易造成污染。 |
2 | 底物污染,未避光保存,出现颜色 | 弃去底物,重新配置 | |
3 | 样品稀释液污染 | 弃去稀释液,重新配置 | |
4 | 吸头重复使用,未洗净或消毒不彻底 | 吸头尽可能一次性使用 | |
5 | 不正确的孵育时间,温度(尤其是底物孵育的时间) | 最为常用的温育温度有37℃和室温,其次是43℃和2~8℃。完全按照说明书要求。 | |
6 | 偶联抗体(streptavidin-HRP)浓度过高 | 按照说明书调整到最佳的浓度 | |
7 | ELISA板子不正确的贮存 | 酶标板贮存于2-8 ℃;使用结合力低点的Elisa板 | |
8 | 没有正确封闭 | 在标准品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间 | |
9 | 样本溶血严重 | 建议使用非溶血或轻微溶血样本,严重溶血样本会导致背景偏高。 | |
重复性不佳,高CV值 | 1 | 样品不均一 | 加样前充分混匀样品,取样确保移液位置一致; |
2 | 包被板表面遭到破坏 | 洗板加样时尽量小心,避免破坏板的包被表面 | |
3 | 孔与孔之间的交叉污染 | 孵育后取下盖子小心操作,避免孔与孔的污染;封板膜不能重复使用 | |
4 | 加样量不一致 | 样品稀释前应充分混匀,尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴 | |
5 | 边缘效应(外周孔显色较中心孔深) | 孵育时尽量100 rpm旋转混匀 | |
6 | 微量加样不准确 | 保证微量加样的准确性和均一性 | |
7 | 不正确的洗涤 | 洗液准确配制;充分洗涤,静置15秒,确定每一步的洗涤 | |
出现白板,阳性对照不显色 | 1 | 显色液变质 | 更换新的显色液 |
2 | 洗涤液配制有误 | 请按说明书所示稀释倍数配制 | |
3 | 未加酶结合物而认为已加入 | 注意不要漏加 | |
4 | 终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用 | 每次加液前均应看清标签 | |
5 | 标准品稀释方法错误/或标准品有问题 | 请按照说明书所示配置说明书,注意单位和稀释倍数 | |
6 | 不同试剂盒或不同批号的试剂混用 | 建议使用同批次试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。 | |
不正常的标准曲线 | 1 | 错误的方法重悬标准品 | 加入正确量的溶液重悬标准品,重悬充分 |
2 | 标准品稀释错误 | 按照说明书要求稀释标准品 | |
3 | 标准品污染 | 使用一次性的灭菌吸头, 标准品贮存于2-8 ℃ | |
4 | 错误的倍比稀释步骤 | 按照说明书倍比稀释标准品 | |
5 | 波长选择错误 | TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用,而 前者比色波长为450nm,后者为492nm。双波长比色分析优于单波长。 | |
6 | 标准品混用 | 不同批号试剂勿混用 | |
7 | 试剂盒在运输途中时间太长,温度太高,标准品失活 | 尽量缩短运输时间,夏季应放冰块降温 | |
8 | ELISA未终止而直接检测450nm和620nm | TMB显色需终止后检测,否则会出现620nm比450nm读数高的现象。(数值仍有梯度规律) | |
样品或标准品OD超出正常范围 | 1 | 错误的样品或标准品的稀释 | 完全按照说明书稀释 |
2 | 偶联抗体浓度过高 | 按照说明书调整到最佳的浓度 | |
3 | TMB底物孵育时间过长 | 调整到合适的孵育时间 | |
4 | 样品或标准品污染 | 避免污染 | |
5 | 错误的孵育时间或温度 | 完全按照说明书 | |
6 | 孵育时未加盖导致溶液挥发和污染 | 贴封片或加盖 | |
标曲很好,但是样本无法计算到数值 | 1 | 标曲选择不合适 | 选择最合适的标曲拟合; |
2 | 样本含量很低,低于灵敏度无法被检测到 | 尝试浓缩样本或使用高敏ELISA试剂盒检测 | |
3 | 样本含量很高,超过标曲 | 建议进行预实验摸索稀释倍数,确保样本OD值落在标曲范围内 | |
标曲高浓度间无明显趋势 | 1 | 如OD绝对值靠谱,但是仅无梯度,则显色过度 | TMB显色体系中建议根据S1,S2颜色进行判断,当S1,S2深蓝色,有明显梯度,S5有淡蓝色时即可终止。 |
2 | 仅作单波长检测。 | 由于参考波长读取非特异性检测,如指纹、划痕、水渍等,对结果也有影响。建议最终结果以双波长为最准确。 |
植物检测试剂盒原理和使用方法
白介素ELISA试剂盒结果异常的原因
五种常用细胞组织染色方法介绍
标准物质期间核查内容与方法
相关产品
鸭子神经肽Y(NP-Y)ELISA试剂盒
鸭子磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)ELISA试剂盒
鸭子催乳素(PRL/LTH)ELISA试剂盒
鸭子刺鼠相关蛋白(AGRP)ELISA试剂盒
鸭免疫球蛋白E(IgE)ELISA检测试剂盒
鸭环磷酸腺苷(cAMP)ELISA检测试剂盒
菠菜蔗糖磷酸合酶(SPS)ELISA试剂盒
菠菜葡萄糖苷酸酶β(GUSβ)ELISA试剂盒
菠菜凝集素(PHA)ELISA试剂盒
菠菜硫氧化还原蛋白(Trx)ELISA试剂盒
菠菜交替氧化酶(AOX)ELISA试剂盒
吲哚乙酸氧化酶测试盒 可见分光光度法
果胶裂解酶测试盒 微量法
吲哚乙酸氧化酶测试盒 微量法
多聚半乳糖醛酸酶(PG)测试盒 可见分光光度法
关注
拨打电话
留言咨询