实时聚合酶链反应(pcr)是基于pcr的革命性方法,这一技术是pcr高灵敏度和实时检测相结合的结果。实时定量聚合酶链反应(rt-qpcr)的独特特征就是把目的基因的扩增与荧光信号联系起来,并将其量化。
在定量基因表达分析,目前有两种方法最受欢迎, sybr green and taqman,那么这两种哪个更好呢?本文分别分析其优缺点。
一、荧光染料法(sybr green)
其原理是:在pcr反应体系中加入过量荧光染料,dna扩增的过程中,荧光染料特异性地掺入dna双链,发射荧光信号,随着反应的进行,荧光强度逐渐增强,并且可以实时测量。如果你要扩增你的目标样品40个循环,在最后一个循环结束时检测到的荧光会比在第10个循环测得的荧光强很多。
优点:
成本较低,适合大规模的实验。
在实验设计阶段非常省时,因为它只需要合适的引物设计。
缺点:
特异性不是很高。染料可以插入任何双链dna,包括引物二聚物和非特异性产物。
如果引物二聚体存在或者产物受到污染,得到的结果会不可靠。
更容易与低丰度的目标产生非特异性荧光。
需要更多的时间进行结果分析。
二、寡核苷酸探针(taqman)
这种方法涉及使用荧光标记的寡核苷酸(短dna分子),探针通常在5 '端和3 '端都被标记。
在探针的5’端有报告基团,3’端设计淬灭基团,当报告基团接近淬灭基团时,不会检测到荧光信号。rt-qpcr反应时,寡核苷酸两个基团分离,即可检测到荧光信号,并与pcr产物同步。
使用这种方法的荧光检测依赖于两个过程:1)引物与目标序列的结合(2)探针与引物下游
互补序列的结合。
优点:
更有可能只放大所需的产物,由于引物和探针的结合具有特异性。
不需要解离曲线,只有探针与正确的目的序列结合时才能检测到荧光。
由于具有特异性,数据更可靠。
数据分析时节省时间。
缺点:
需要大规模实验时耗费成本高。
需要更长的时间来设计实验,因为需要好的引物和探针。
总的来说,这两种荧光检测方法都很有效,但对于你的具体实验,可以选择适合的方法。
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