实验原理
琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定 DNA、RNA 分子混合物,以琼脂凝胶作为支持物,利用 DNA
分子在电场中时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA
分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中由阴极向阳极运动。在一定的电场强度下,忽略DNA分子携带的电荷,DNA
分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与相对分子量成反比。
不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。如环形 DNA 分子样品,其中有三种构型的分子:超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形 DNA 分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA>IDNA>ocDNA。
核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质。琼脂糖是一种聚合链线性分子;聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)在
N,N,N′-四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)的催化下聚合形成长链,并通过交联剂
N,N′-亚甲双丙烯酰胺(Bis)交叉连接而成。琼脂糖凝胶适合分离200bp至近50kb的DNA-片段,而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段(5bp-500bp)的分离效果最hao,且分辩力极高。选择不同浓度的凝胶,可以分离丌同大小范围的
DNA 分子。电场强度愈大,带电颗粒的运动赹快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小,所以电泳时一般采用低电压,不超过
6V/cm。而对于大片段电泳,可以选择 0.5-1.0V/cm 电泳过夜。如果选择高电压电泳,可使用聚丙烯酰胺凝胶。
核酸电泳常采用 TAE、TBE、TPE 三种缓冲系统。TAE 价格低廉,但缓冲能力低。TPE 在进行 DNA 回收时,会使 DNA 污染磷酸盐,影响后续反应。所以综合考虑,多采用 TBE 缓冲液。
核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭(EB)。溴化乙锭是一种扁平分子,可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射 BE-DNA 复合物时,通过发光指示核酸的位置。由于EB有较强的挥发性和毒性,现在大多选择EB替代品进行试验,比较常用的有gelred,goldview,ybr-green等,但是整体效果都若于传统的EB。
材料、试剂及器具
1、材料
合适的Marker(分子量标准);DNA 样品
2、试剂
加样缓冲液(6x或10x);琼脂糖;溴化乙锭(EB)。
3、器具
(1)电泳系统:电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。
(2)凝胶成像系统或紫外透射仪。
实验过程
1、按所分离的 DNA 分子的大小范围,选择合适的比例的凝胶,称取适量的琼脂粉,放到一锥形瓶中,加入适量的 TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至琼脂粉完全溶化,溶液透明。稍摇匀,得胶液。待胶液却至 60℃左右,在胶液内加入适量的比例的溴化乙锭液。
2、水平放置胶槽,在一端插好梳子,在槽内缓慢倒入已况至 60℃左右的胶液,使之形成均匀水平的胶面。
3、待胶凝固后,小心拔起梳子,使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。
4、在槽内加入TBE电泳缓冲液,至液面覆盖过胶面。
5、把待检样品,按合适比例与加样缓冲液混匀,用移液枪加至凝胶的加样孔中。
6、接通电泳仪和电泳槽,并接通电源,调节合适电压,稳压输出,开始电泳。
7、观察溴酚兰的带(蓝色)的位置。当其移动至约凝胶长2/3处时,可停止电泳。
8、在紫外透shi仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜,赶去气泡平铺,然后把凝胶放在上面。关上样品室外门,打开紫外灯(360nm 或 254nm),通过观察孔进行观察。
注意事项
1、电泳中使用的溴化乙锭(EB)为中度毒性、强致癌性物质,务必小心,勿沾染于衣物、
皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门电泳区域操作,戴一次性手套,并及时更换。
2、预先加入EB 时可能使 DNA 的运动速度下降15%左右,且不同构型的 DNA 的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解,若凝胶放置一段时间后才观察,即使原来胶内或样品已加 EB,建议选择EB溶液浸泡染色。
3、加样进胶时不要形成气泡,需在凝胶液未凝固之前及时清除,否则,需重新制胶。
4、电泳时溴酚兰在琼脂糖凝胶中的运动速度可以用于参考电泳速度,已实际电泳条带运动速度为准。
常见问题分析
常见问题 | 原因 | 对策 |
DNA条带模糊 | DNA降解 | 实验过程避免核酸酶污染 |
电泳缓冲液陈旧 | 电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,PH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。TBE建议使用10次就更换缓冲液 | |
所用电泳条件不合适 | 电泳时电压不应超过6V/CM,温度<30℃,巨大DNA链电泳,温度应<15℃,核查所用电泳缓冲液的缓冲能力,注意经常更换 | |
DNA上样量过多 | 减少凝胶中DNA上样量 | |
DNA含盐过高 | 电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分 | |
有蛋白污染 | 电泳前酚抽提去除蛋白 | |
DNA变性 | 电泳前勿加热,用TE缓冲液稀释DNA | |
出现片状拖带或涂抹带 | PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往PCR体系需要优化,PCR程序需要摸索。 | 其对策有:调整PCR体系和PCR程序,摸索出合适的条件。 |
不规则DNA带迁移 | 电泳条件不合适 | 电泳时电压不应超过6V/CM,温度<30℃,巨大DNA链电泳,温度应<15℃,核查所用电泳缓冲液的缓冲能力,注意经常更换 |
DNA变性 | 电泳前勿加热,用TE缓冲液稀释DNA | |
带弱或无DNA带 | DNA上样量不够 | 增加DNA上样量,聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高,上样量可适当降低 |
DNA降解 | 实验过程避免核酸酶污染 | |
DNA跑出凝胶 | 缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度 | |
EB染色的DNA,所用光源不合适 | 应用短波长(254nm)的紫外光源 | |
DNA带缺失 | DNA跑出凝胶 | 缩短电泳时间,降低电压,增强凝胶浓度 |
分子大小相近的DNA带不易分辨 | 增加电泳时间,核准正确凝胶浓度 | |
DNA变性 | 电泳前勿加热,用20mM Nacl 缓冲液稀释DNA | |
DNA链巨大,常规凝胶电泳不合适 | 在脉冲凝胶电泳上分析 | |
电泳时Ladder扭曲 | 配胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配置 | 同时配置,电泳缓冲液高出液面1-2mm即可 |
电泳时电压过高 | 电泳时电压不应超过6V/CM |
植物检测试剂盒原理和使用方法
白介素ELISA试剂盒结果异常的原因
五种常用细胞组织染色方法介绍
标准物质期间核查内容与方法
相关产品
鸭子神经肽Y(NP-Y)ELISA试剂盒
鸭子磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)ELISA试剂盒
鸭子催乳素(PRL/LTH)ELISA试剂盒
鸭子刺鼠相关蛋白(AGRP)ELISA试剂盒
鸭免疫球蛋白E(IgE)ELISA检测试剂盒
鸭环磷酸腺苷(cAMP)ELISA检测试剂盒
菠菜蔗糖磷酸合酶(SPS)ELISA试剂盒
菠菜葡萄糖苷酸酶β(GUSβ)ELISA试剂盒
菠菜凝集素(PHA)ELISA试剂盒
菠菜硫氧化还原蛋白(Trx)ELISA试剂盒
菠菜交替氧化酶(AOX)ELISA试剂盒
吲哚乙酸氧化酶测试盒 可见分光光度法
果胶裂解酶测试盒 微量法
吲哚乙酸氧化酶测试盒 微量法
多聚半乳糖醛酸酶(PG)测试盒 可见分光光度法
关注
拨打电话
留言咨询