做转染实验时小编就抱着一个信念,就是要给细胞点“颜色”看(荧光),但你知道吗?就这个简单的实验过程,小小的细胞却有着大大的能量,实验过程中带阳离子的脂质体充当着“搬运工”的角色将质粒从胞外“抓”到胞内,而细胞为质粒的复制、转录、翻译提供“场所和原材料”,自己也跟着“增光填色”,但“上色”过程中会遇到一些问题,总结下来主要有以下二个方面:
细胞状态差
转染效率低
Q1:转染后细胞状态较差
A:分析:主要是铺板和反应液配制的原因
细胞状态是整个实验的关键,如果细胞状态不好,则转染后细胞状态当然就好不了
铺板:过多或不均匀,细胞长的太满就会状态较差
脂质体本身有毒性,如果脂质体加入量太多,会导致细胞状态较差,或者细胞死亡,建议在做正式实验前,先做一下预实验,摸索一下质粒和脂质体的配比。
Q2:转染后荧光效率低
A:分析:主要是细胞原因和“搬运”过程中的问题
1、细胞状态仍然是重中之重,如果有一段时间转染效果很不理想,必须要换一批次细胞;
2、加入目的质粒后轻轻混匀,太用力会破坏混合液的结构,
3、质粒与转染试剂的比值: 过高一部分质粒不能进入细胞,过低“搬运工”太多,有毒性且浪费;
4、吸、打液体时注意枪头内液面高度,是否完全打出;
5、反应液配好后等待20min,质粒才会被完全包裹;
6、反应液滴加加入细胞,使“脂质体+质粒”均匀分布;
7、质粒反复冻融影响浓度,尽量减少冻融次数;脂质体 -20℃保存,用完应马上放回;
8、必要时需要检测一下质粒的浓度是否准确;
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