什么是内毒素?
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖(LipopolySaccharide,LPS)和蛋白的复合物,当细菌裂解时便会大量释放出来。内毒素单位为EU。
内毒素对试验的影响
内毒素存在极大程度地影响转染效率。同时内毒素还可能激活免疫细胞的非特异反应,造成实验中的假阳性。因此,为了保证高转染率和转染细胞高存活率,必须从质粒制备的过程中将内毒素去除。
内毒素和质粒的关系
由于内毒素两亲性和负电荷性,性质类似于DNA,因此在质粒纯化中会伴随质粒一同被纯化出来。质粒中内毒素含量的高低常用EU/μg质粒表示。
按照EU/μg大小,质粒被分为三个级别:测序级别(>50EU/μg)、转染级别(<50EU/μg)和无内毒素级别(<0.1EU/μg)。
再次强调
当你提取的质粒DNA是为了转染原代细胞、悬浮细胞或者敏感细胞;进行基因沉默研究、细胞注射显微操作;进行基因治疗或者DNA疫苗等要求极为严格的实验,就应该考虑Endotoxin-Free的质粒。
2017年3月,张锋课题组在《Nature Protocols》发表的《Genome-scaleCRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening》中,Endotoxin-Free的质粒获得被列为 Critical Step,同时推荐该厂家的NucleoBond Endotoxin Free Plasmid DNA kit,可避免病毒包装和细胞培养过程中减少了内毒素残留的影响。
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