植物DNA的提取和纯化是植物基因工程研究的基础操作。实施分子标记、基因图谱、基因指纹图谱、基因文库构建、遗传多态性分析、DNA重组、RAPD(随机引物多态性DNA)、RFLP(限制性酶多态性)、基因分离及遗传转化和鉴定等都以提取DNA为前提。
目前,对从植物组织中提取DNA方法的要求是:简便、有效、快捷以及经济。与动物组织相比,植物组织含有较多的多糖和其他次生代谢产物(酚、酯、萜、色素等),这给高质量的DNA提取带来较多的困难。尤其是多糖成分是影响DNA纯度最常见的问题。如何做到既去除这些污染物又能相对保持高的产量,并且能简捷有效地提纯,一直是植物生物技术研究者探索的问题。
对于普通的植物(低酚、低酯、低糖等)如:水稻、白菜、苋菜、南瓜、黄瓜、西红柿、上海青、菠菜、笋瓜、冬瓜、莲藕、山药、竹笋等;我们可以选用普通植物DNA提取试剂盒(磁珠法)试剂
对于多糖、多酚类植物(香蕉、西瓜、苹果、梨等果肉,红薯、马铃薯等块茎,棉花、月季、枇杷、益母草、夏枯草等人参、曼陀罗、向天果、射干、桔梗、满山红、金鸡纳霜等药用植物)可以选用多酚植物DNA提取试剂盒(磁珠法)试剂,针对类似的植物我们经过长期的优化,可以得到较好的实验结果。
以叶片为例,叶片需先剪碎成小块,以便放入1.5ml离心管。最佳样本的长度应在1cm 以下。重量不超过250mg,推荐使用50mg,如果是植物种子粉末可以使用10mg-20mg粉末即可。
一、匀浆介质
一般采用 0.05 mol/L Tris-HCl,pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS),客户可根据样本及测定方针的状况自行设定浓度,目的是坚持样本的等渗环境。
二、组织匀浆的制备
1、取组织块(0.2g~0.5g)可到 5~10mg 在严寒的 PBS 中漂洗,滤纸拭干,称重,放入 5ml 的匀浆管中。
2、按重量 (g):体积 (ml)=1:4 的比例参与 4 倍体积的匀浆介质于匀浆管中,冰水浴条件下,用眼科小剪赶快剪碎组织块。
3、匀浆的方法:手工匀浆,机器匀浆。
① 手工匀浆:左手持匀浆管将下端刺进盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆笔直刺进套管中,上下转动研磨数十次(6~8 分钟),充沛研碎,制成 20% 的匀浆液。
② 机器匀浆:用组织捣碎机 10000~15000 转 / 分 上下研磨制成 20% 组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间 10 秒 / 次,空隙 30 秒,接连 3~5 次,在冰水中进行,可适当延伸匀浆时间),
4、将制备好的 20% 匀浆液用一般离心机或低温低速离心机 4000 转 / 分左右,离心 10~15 分钟,取上清液进行测定.
三、样本保存
植物组织样本暂时不测定,可立即低温冻存,温度越低越好,中心如不重复冻融,-20 ℃ 以下可保存三个月,-70 ℃ 以下可保存六个月。 制备好的匀浆液主张不要冻存,当天进行测定,如放置时间过长相关酶活会有所下降,部分方针 4 ℃ 可存放 3~5 天(如 SOD 要存放 2~3 天,MDA 可存放 3~5天,总蛋白测定可存 5~7 天)。
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