RIPA 裂解液用于样品总蛋白提取已经有三十多年的时间,但是他到底适不适合你的下游实验,这个事你考虑过吗?比如 RIPA 提到的蛋白图谱是否完整? 和其他方法对比提取的蛋白有哪些差异?使用时有没有潜在问题?一句话:RIPA 到底靠不靠谱?
研究方法
分别使用 RIPA 和 2%SDS+超声提取未激活 T 淋巴细胞(Lanes 1 和 5)和激活的 T 淋巴细胞(Lanes 2-4 和 6-8)裂解细胞提取总蛋白
WB 进行 caspase-3, caspase-7, parp and GD1 活性检测
主要发现
p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中,但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中却不存在。证明了 RIPA buffer 提取蛋白时会人工激活 caspase-3 and caspase-7。
划重点:细胞凋亡研究时要慎用 RIPA
1、 研究方法
培养的结肠癌细胞分别使用 RIPA 和 NP-40 提取
用特异性单克隆抗体进行免疫共沉淀
使用同样量 pp60-src 沉淀蛋白进行激酶检测
主要发现
使用 RIPA 提取蛋白,激酶活性比 NP-40 提取高了七倍
RIPA buffer 人工增加激酶活性
划重点:激酶活性检测时要慎用 RIPA
2、 研究方法
研究使用化学诱导和无诱导的人细胞系,总蛋白分别使用 RIPA 和柱式法蛋白提取
蛋白通过 SDS-PAGE 分离,进行 WB 检测磷酸化蛋白的对比
NT=细胞没有通过化学处理激活(基线水平),T=细胞通过化学激活处理。化学激活后,磷酸化蛋白(P)预期应比基线水平(NT)增加,非磷酸化蛋白(np)减少。
3、主要发现
通过 actin 条带强度可以证明蛋白样品是等量上样
STAT3 在两种提取方法中显示了同样的趋势
P56 在两种提取方法中却显示明显的不同
离心管柱法提取蛋白获得了预期的结果,但是 RIPA 获得了完全相反的结果
4、研究方法
野生型和突变型乳腺上皮细胞通过 RIPA 裂解液裂解,通过离心获取 RIPA 可溶性和不可溶性组份
RIPA 不可溶性组份用 SDS-PAGE 样品缓冲液溶解,使用多种抗体进行验证
5、主要发现
RIPA 不可溶性组份中有明显的蛋白丢失情况
野生型和突变型样品均有丢失蛋白,包括磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白(pY-416c-Src)
划重点:在某些蛋白质磷酸化研究中慎用 RIPA
6、研究方法
使用 RIPA buffer 提取乳腺癌组织中总蛋白
RIPA 方法提取丢弃的不可溶性组份通过尿素裂解液再次提取蛋白
通过质谱分析两部分蛋白质图谱
7、主要发现
RIPA buffer 提取后不可溶性组份中含有很多种蛋白
几乎所有的细胞外基质蛋白都存在于不溶性组分中
不溶性组分中蛋白质的分子量平均高出 60%
RIPA 在 4 种乳腺癌样品提取中都产生了明显的蛋白丢失,主要是高分子量蛋白
划重点:细胞外基质研究时慎用 RIPA
8、研究方法
小鼠组织样品分别使用离心管柱法和 RIPA buffer 提取总蛋白
RIPA 提取后不可溶组份进一步使用离心管柱法进行提取
提取后的蛋白通过 SDS-PAGE 分离,考染进行对比
9、主要发现
RIPA 不可溶组份仍可以提取出蛋白,分子量从小于 20KD 到大于 120KD 范围,证明 RIPA 提蛋白有丢失
最明显的区域是低分子量蛋白
蛋白丢失是具有选择性,且不成比例的
不同的样品间蛋白丢失的图谱是不同的
划重点:定量,定性蛋白研究慎用 RIPA
What?看完一脸懵 X 吗?用了这么久的 RIPA 居然有这么多慎用,这也太不靠谱了,那该怎么办?
如果正在做以上实验研究遇到问题,那么务必要使用不同提取蛋白的方法来验证结果!
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